慢性鉛暴露對小鼠學(xué)習(xí)記憶功能及大腦皮層神經(jīng)元PI3K-PKB信號分子的影響.pdf

1、目的：鉛是環(huán)境中一種具有很強(qiáng)神經(jīng)發(fā)育毒性的毒物，即使是低水平暴露，仍然可以損害發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，影響兒童的學(xué)習(xí)記憶能力和神經(jīng)行為。由于兒童血腦屏障發(fā)育不完整，當(dāng)血鉛水平達(dá)到100μg/L時(shí)便能導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶及行為異常，引起兒童不可逆的神經(jīng)系統(tǒng)損害。因此預(yù)防和治療兒童鉛中毒是涉及保護(hù)我國三億兒童身心健康以及保證我國人民子孫后代富國強(qiáng)民的大事。目前鉛致神經(jīng)中毒機(jī)制仍不清楚。 蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)與

2、蛋白激酶A和蛋白激酶C高度同源。因其與人類病毒癌基因V—Akt高度同源，故名Akt。PKB/Akt途徑可激活多種底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存、分化、增殖和代謝等[1]。Erin等報(bào)道PKB/Akt也參與神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的存活、分化、凋亡等[2]。有研究指出[3]PI3K激活下游的PKB/Akt等參與海馬CA1區(qū)LTP的表達(dá)，而與LTP的誘導(dǎo)無關(guān)。LTP表達(dá)是以AMPA受體功能持續(xù)增強(qiáng)為特點(diǎn)的。而且PI3K能促進(jìn)膜上AMPA受體的功能加強(qiáng)與受體數(shù)

3、量增加。PI3K是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的影響LTP表達(dá)的因子，為此其作用備受關(guān)注。 鉛是環(huán)境中一種主要的、具有很強(qiáng)神經(jīng)發(fā)育毒性的毒物，即使是低水平暴露，仍然可以損害發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，影響人類的學(xué)習(xí)記憶能力和神經(jīng)行為[4]。研究指出，多種蛋白激酶參與學(xué)習(xí)記憶過程。鉛對小鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞PKB表達(dá)的影響未見報(bào)導(dǎo)。 本課題建立染鉛小鼠動(dòng)物模型，觀察不同濃度鉛對小鼠記憶行為(水迷宮、跳臺試驗(yàn))的影響；觀察不同濃度鉛對小鼠皮層神經(jīng)元

4、PI3K/PKB信號分子表達(dá)的影響，探討PI3K/PKB信號分子與鉛致神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)記憶功能異常的關(guān)系，為探討PI3K/PKB信號分子在神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的代謝、存活、分化、增殖、凋亡及LTP中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法：昆明系小鼠由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按每籠雄：雌為1：2自然交配，隨機(jī)分為五組，依次分為對照組和2.4、4.8、7.6、9.mmol/L醋酸鉛組。從出生第一天起開始通過飲水飼以不同濃度醋酸鉛水溶液。對照組飲用

5、自來水。低、中、高劑量鉛中毒組飲用含2.4、4.8、7.6、9.6mmol/L醋酸鉛水溶液。自第21d起，幼鼠開始自己飲用與其母鼠相同的飲用水。于出生后第42d解剖動(dòng)物取出大腦皮層，放入液氮中，轉(zhuǎn)存到—70℃冰箱中。第42d開始進(jìn)行水迷宮和跳臺實(shí)驗(yàn)，觀察鉛對小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響。 取對照組與染鉛組小鼠大腦皮層標(biāo)本，利用PI3K和PKB多克隆抗體，經(jīng)Western blot方法測定PI3K和PKB在皮層神經(jīng)元的表達(dá)。證明鉛是通過

6、影響P13K和PKB表達(dá)而學(xué)習(xí)記憶功能的，為揭示老年癡呆癥等發(fā)病機(jī)制提供新的研究方向。 結(jié)果： 1、慢性鉛暴露對小鼠血鉛和腦鉛含量的影響 小鼠出生后42d進(jìn)行血鉛和腦鉛含量進(jìn)行測定，各慢性染鉛組小鼠血鉛和腦鉛含量均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，升高的程度與飲用水的鉛濃度呈正相關(guān)。9.6mmol/L醋酸鉛組明顯高于2.4mmol/L醋酸鉛組。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、慢性鉛暴露損傷小鼠空間

7、學(xué)習(xí)記憶及被動(dòng)回避反應(yīng)學(xué)習(xí)記憶能力 在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果表明慢性鉛暴露可明顯損傷小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，損傷程度與飲用鉛的濃度成正相關(guān)； 在跳臺試驗(yàn)中，結(jié)果表明慢性鉛暴露可明顯損傷小鼠的被動(dòng)回避反應(yīng)的獲得與保持能力，其損傷程度亦與飲用鉛的濃度成正相關(guān)。 3、慢性鉛暴露對小鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞PI3K/PKB信號分子的影響 蛋白免疫印跡檢測結(jié)果顯示：4.8、9.6mmol/L醋酸鉛組鼠腦海馬PI3K蛋白的表

8、達(dá)與相應(yīng)期對照組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Pearson相關(guān)分析顯示，PI3K表達(dá)與血鉛濃度呈負(fù)相關(guān)(γ=-0.82，P<0.01)，即血鉛、腦鉛的濃度越高，PI3K表達(dá)降低越明顯。PI3K表達(dá)與學(xué)習(xí)記憶能力損傷程度比較呈負(fù)相關(guān)(r=-0.671，P<0.01)，即p-PKB表達(dá)降低越明顯，損傷程度越嚴(yán)重。 與對照組相比，染鉛組的總量PKB蛋白(t-PKB)與對照組相比無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。染鉛組p-P

9、KB表達(dá)有顯著性降低(P<0.01)，并呈濃度依賴性。染鉛組的總量PKB蛋白與對照組相比無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。Pearson相關(guān)分析顯示，p-PKB表達(dá)與血鉛濃度呈負(fù)相關(guān)(γ=-0.82，P<0.01)，即血鉛、腦鉛的濃度越高，p-PKB表達(dá)降低越明顯。p-PKB表達(dá)與學(xué)習(xí)記憶能力損傷程度比較呈負(fù)相關(guān)(γ=-0.671，P<0.01)，即p-PKB表達(dá)降低越明顯，損傷程度越嚴(yán)重。 結(jié)論： 1、慢性染鉛使小鼠血

10、鉛和腦鉛含量均明顯高于對照組，升高的程度與飲用水的鉛濃度呈正相關(guān)。 2、慢性鉛暴露可明顯損傷小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。學(xué)習(xí)記憶能力損傷程度與血鉛、腦鉛的濃度呈正相關(guān)，即隨血鉛、腦鉛的濃度升高，空間學(xué)習(xí)記憶損傷程度越嚴(yán)重。 3、慢性鉛暴露導(dǎo)致小鼠大腦皮層神經(jīng)元PI3K、p-PKB的表達(dá)降低，而不影響t-PKB的表達(dá)。慢性鉛暴露時(shí)PI3K/PKB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑表達(dá)降低，進(jìn)而損傷LTP，導(dǎo)致學(xué)習(xí)功能異常。這可能是鉛致小鼠學(xué)習(xí)記憶功