TGEV S基因、N基因雙順反子DNA疫苗的構(gòu)建研究.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的一種危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要腸道傳染病，該病毒的N、S蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。應(yīng)用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體制備多價(jià)核酸疫苗在基因免疫的研究中具有重要意義，通過構(gòu)建雙表達(dá)載體的方法將TGEV的S和N基因聯(lián)合應(yīng)用是一種有效且簡便易行的方法。本研究以pVAX1為基礎(chǔ)構(gòu)建了通用的雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pVAXD；將TGEVS基因主要抗原位點(diǎn)片斷Sa和N基因同時(shí)插入pVAXD，構(gòu)建了真核雙順反子

2、表達(dá)載體pVAXD-N-Sa，對其免疫原性進(jìn)行了初步研究。 1.真核雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pVAXD的構(gòu)建通過對載體pVAX1，多克隆位點(diǎn)的改造，分別構(gòu)建出pVAXA和pVAXB。用PCR方法從載體pVAXA上擴(kuò)增含-PCMV-MCS-BGHpolyA-的表達(dá)單元片段，插入pVAXB，組裝成雙啟動(dòng)予表達(dá)載體pVAXD。在pVAXD中分別插入DsRed和EGFP基因，構(gòu)建單表達(dá)質(zhì)粒pVAXD-DsRed和pVAXD-EGFP，再在pVA

3、XD-DsRed中插入EGFP基因構(gòu)建雙表達(dá)質(zhì)粒pVAXD-EGFP-DsRed。將以上重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，用熒光顯微鏡觀察，結(jié)果雙表達(dá)質(zhì)粒與單表達(dá)質(zhì)粒相比同一種熒光蛋白表達(dá)強(qiáng)度無明顯差異，且雙表達(dá)質(zhì)粒pVAXD-EGFP-DsRed中兩種熒光蛋白間表達(dá)強(qiáng)度相當(dāng)。結(jié)果表明載體pVAXD構(gòu)建成功，能夠同時(shí)表達(dá)兩個(gè)外源基因。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的雙啟動(dòng)子載體為進(jìn)行基因表達(dá)的研究提供了新的工具，并為雙價(jià)DNA疫苗的研制和提高核酸疫苗

4、免疫效率的研究奠定基礎(chǔ)。 2.TGEV雙順反子核酸疫苗pVAXD-N-Sa的構(gòu)建分別從pMD19T-Sa、pMD19T-N上擴(kuò)增S基因主要抗原位點(diǎn)片斷Sa和N基因。將TGEVSa片斷和N基因分別插入載體pVAXD中，構(gòu)建出單表達(dá)質(zhì)粒pVAXD-Sa和pVAXD-N。在pVAXD-Sa上插入N基因構(gòu)建出雙表達(dá)質(zhì)粒pVAXD_N-Sa。將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，通過RT-PCR法檢測表達(dá)情況。結(jié)果pVAXD-Sa和p

5、VAXD-N組能分別擴(kuò)增出約2.1kb和1.2kb的條帶，而pVAXD-N-Sa組能同時(shí)擴(kuò)增出1.2kb和2.1kb的兩條帶，從而從mRNA水平證實(shí)在載體pVAXD-N-Sa中N基因和sa片斷得到了共表達(dá)，初步實(shí)現(xiàn)了N和Sa的體外共表達(dá)。 3.TGEV雙順反子核酸疫苗pVAXD-N-Sa免疫原性的初步研究將重組質(zhì)粒pVAXD-Sa、pVAXD-N、pVAXD-N-Sa以及混合質(zhì)粒pVAXD-N+pVAXD-Sa免疫小鼠，用ELI

6、SA方法檢測小鼠抗體水平變化。pVAXD-Sa、pVAXD-N-Sa、DVAXD-Sa+pVAXD-N組在首免后第14d可檢測到抗TGEV陽性抗體，并且在第35d出現(xiàn)高峰。pVAXD-N在首免后第28天檢測到抗TGEV陽性抗體，在第42d出現(xiàn)高峰。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)pVAXD-N-Sa和DVAXD-Sa+DVAXD-N免疫組誘導(dǎo)的ELISA抗體水平高于pVAXD-Sa和pVAXD-N免疫組，而雙表達(dá)組與混合質(zhì)粒組間無明顯差異。結(jié)果表明，重組真核