禽傳染性支氣管炎病毒分離株的全基因組及S1、M、N基因DNA疫苗研究.pdf

1、禽傳染性支氣管炎(IB)呈世界廣泛流行，是危害養(yǎng)雞生產最嚴重的病毒性傳染病之一。由于禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)很容易發(fā)生變異，導致新的變異株不斷出現(xiàn)，且不同毒株之間交叉保護力弱，使該病經常在免疫和非免疫的禽群爆發(fā)，造成了嚴重的經濟損失。在前期工作基礎上，本研究對IBV腎型分離株SAIBk株的全基因組和11株分離株的3’端非編碼區(qū)進行了序列測定和分析，并進一步構建了SAIBk株S1、M、N基因的熒光融合表達質粒并在細胞中進行表達研究，

2、在此基礎上構建了S1、M、N基因的真核表達質粒并對其免疫原性進行了比較研究，為從分子水平研究IBV的流行進化及研制預防和控制IB的DNA疫苗奠定基礎。 1.選擇具有一定代表性的IBV致腎病變型分離株SAIBk株，采用RT-PCR方法將其基因組分19個片段進行了擴增、測序及分析。結果表明：sAIBk株能引起雞胚矮化，形成侏儒胚；其病毒經蔗糖密度梯度離心純化后，在電鏡下可觀察到典型的冠狀病毒粒子；SAIBk株基因組全長27520bp

3、，核苷酸組成中A+T的含量占61.74％；具有典型的冠狀病毒基因組結構，其528-204：10位為RNA依賴的RNA聚合酶基因，編碼兩個多聚蛋白ORFla和ORFlb，20361-27155位主要編碼病毒的各種結構蛋白，包括S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白；SAIBk株與Beaudette、Mass41、Ca199、BJ、KQ6基因組序列的同源率介于85.6％-87.6％之間；不同區(qū)域的同源性比較結果表明，3’UTR和5’UTR是基因組中

4、最為保守的區(qū)域，同源率介于90％-98％之間，而S1基因是基因組中變異最大的區(qū)域，同源率介于74.8％-83.2％之間。本試驗在國內外首次對IBV腎型分離株的基因組全序列進行了測定，豐富了冠狀病毒的生物信息數(shù)據庫，為進一步研究該病的分子流行病學和DNA疫苗奠定了基礎。 2.選擇11株IBV分離株，采用RT-PCR方法對其3’端非編碼區(qū)進行了測序及分析。結果表明：11株分離株3’端非編碼區(qū)的PCR擴增片斷長度介于328bp-512

5、bp之間；將11株分離株與Genbarlk上登錄的15個毒株的序列進行比較分析，表明3’非編碼區(qū)存在大量的堿基插入和缺失，不同毒株之間堿基數(shù)目最大相差208bp；根據不同毒株在3’非編碼區(qū)片段的大小，可以將26個毒株分成4組；26株毒株3’非編碼區(qū)的進化樹分析結果與按照3’非編碼區(qū)片段大小進行分組有較一致的結果。其中的基因Ⅰ型和基因Ⅱ型毒株均屬于第二組，基因Ⅲ型毒株屬于第三組，基因Ⅳ型毒株屬于第四組，而第一組的毒株均為國外分離毒株。本試

6、驗通過測定11株IBV分離株3’端非編碼區(qū)的序列，為IBV分離株的分子流行病學研究提供科學依據。 3.構建S1、M和N基因的熒光融合表達質粒，轉染Vero細胞后觀察結構蛋白在細胞內的表達與分布。結果表明：酶切分析和測序結果證明構建了融合表達質粒pSl-EGFP、pM-EGFP、pN-EGFP、pS1-DsRed、pM-DsRed、pN-DsRed；在S1、M、N結構蛋白上均未分析出有核定位信號；轉染了pS1-EGFt、pS1-D

7、sRed質粒的vero細胞，細胞的胞漿和胞核區(qū)均顯示出綠色熒光或紅色熒光，熒光的強度隨著轉染時間的增加而增強；pM-EGFP、pM-DsRed質粒轉染的Vero細胞，激發(fā)的綠色和紅色熒光僅分布在胞漿區(qū)域，且分布不均勻，表明pM-EGFP、pM-DsRed質粒表達的M-EGFP和M-DsRed在胞漿中發(fā)生了聚集；pN-EGFP、pN-DsRed質粒表達的融合蛋白在胞漿區(qū)域或胞核區(qū)域發(fā)生了部分聚集。本試驗首次構建了S1、M和N基因的熒光融合

8、表達質粒并在細胞中進行了表達研究，為進一步研制的IBV DNA疫苗提供了理論基礎。 4.選擇高效的真核表達載體pcDNA3.1(+)，將分離株SAIBk株的S1、M、N基因分別插入其多克隆位點，構建真核表達質粒pIBVS1、pIBVM和pIBVN，對構建的表達質粒進行酶切和測序鑒定，用脂質體轉染Vero細胞，進行蛋白的表達和鑒定。結果表明：酶切和DNA測序證實重組質粒pI：BVSl、pOBVM、pIBVN構建正確；通過RT-PC

9、R、間接免疫熒光檢測證實工BV的S1、M、N基因能在細胞中正確的轉錄和表達。本試驗構建了S1、M和N基因的真核表達質粒，并在細胞中進行了表達檢測，為進一步的DNA疫苗免疫試驗提供了材料。 5.將構建的pIBVS1、pIBVM和pIBVN質粒單獨或按比例混合進行動物免疫試驗。結果表明：雛雞免疫pIBVS1、pIBVM和pIBVN質粒后，均能產生特異性抗體，對強毒的攻擊具有一定的保護力，其中pIBVM的保護率為37.5％；將pIBV

10、Sl、pIBVM和pIBVN質粒混合免疫所產生的抗體水平和對強毒攻擊的保護力，均要優(yōu)于單基因的效果；將三基因混合的質粒以脂質體為佐劑進行免疫原性研究，在試驗期間脂質體包裹DNA疫苗組與裸質粒疫苗組的抗體水平差異不顯著，但前者的抗體水平一直要高于后者；脂質體包裹：DNA疫苗組的外周血CD4<'+>T、CD8<'+>T淋巴細胞數(shù)量要顯著高于裸質粒疫苗組，兩者差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)；在攻毒保護率上，脂質體包裹DNA疫