禽傳染性支氣管炎病病毒分離株的鑒定及3CL基因片段的序列分析.pdf

1、傳染性支氣管炎病毒感染引起了世界各國(guó)養(yǎng)禽生產(chǎn)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，該病的流行日趨嚴(yán)重，Ⅰ臨床疾病形式多樣化和血清型繁多，這為防制傳染性支氣管炎病毒不斷增加了難度。該病主要表現(xiàn)為引起肉雛雞的高發(fā)病率和高死亡率，常引起混合感染，導(dǎo)致增重減緩和飼料利用率的降低；引起蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)量和蛋的品質(zhì)下降，所造成的生產(chǎn)效益下降通常比直接死亡引起的損失更大，因此對(duì)該病的病原性及其抗原性或血清型進(jìn)行必要的分析研究，顯得尤為的重要。本研究試圖通過(guò)病原學(xué)、血清學(xué)

2、實(shí)驗(yàn)和3CL基因序列分析，分析我省從雞源的傳染性支氣管炎病毒株(GZ株)和孔雀分離得到的傳染性支氣管炎病毒株(PF株)的相關(guān)病原特性、致病性以及這兩個(gè)毒株與實(shí)驗(yàn)室保存的其他三株雞源傳染性支氣管炎病毒株(Massachusetts標(biāo)準(zhǔn)毒株、YX毒株(嗜腎型)和PT毒株(呼吸型))之間的血清學(xué)或抗原型關(guān)系，填補(bǔ)我省對(duì)野禽傳染性支氣管炎病毒病原學(xué)方面的空白，為有效地預(yù)防和控制IBV引起的疾病提供一些參考資料，并為IBV地流行病學(xué)調(diào)查和分類學(xué)工

3、作提供素材。 本研究以五株不同的傳染性支氣管炎病毒株為研究材料，開(kāi)展了病原學(xué)、血清學(xué)和基因序列測(cè)定的研究。 1．從臨床發(fā)病孔雀和雞中用常規(guī)的病毒分離方法采集病料，用SPF雞胚分離得到兩株較典型病變且含量較高的病毒株。 2．采用離子交換捕捉技術(shù)濃縮這兩株病毒株感染的雞胚的尿囊液，經(jīng)負(fù)染后觀察到直徑分別為110nm和125nm，有囊膜，呈圓形，表面有排列整齊的桿狀纖突似花冠狀病毒粒子。 3．血凝實(shí)驗(yàn)：收集不同

4、的接毒時(shí)間的雞胚尿囊液(36h、48h、72h、96h和120h)，尿囊液經(jīng)過(guò)1％胰酶處理過(guò)后，得出未適應(yīng)雞胚的病毒株在接毒48h和72h后收取其尿囊液的血凝效價(jià)高；通過(guò)生理鹽水和PPS兩種緩沖液做對(duì)比，PBS可以使各個(gè)尿囊液表現(xiàn)比較穩(wěn)定的血凝效價(jià)。且各個(gè)尿囊液的血凝價(jià)隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，第4h時(shí)的血凝價(jià)比較穩(wěn)定，同一個(gè)毒株的血凝效價(jià)隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)逐步升高。 4．選擇1日齡的健康狀況良好的SPF雛雞按一定的免疫程序

5、，以點(diǎn)眼滴鼻的接種途徑人工感染雛雞。在雛雞免疫耐過(guò)后，采取其氣管、腎臟、腸、肝臟、肺等器官進(jìn)行病理學(xué)觀察。觀察結(jié)果表明：雛雞肝臟中央靜脈周?chē)?rùn)大量炎性細(xì)胞，部分肝細(xì)胞顆粒變性和空泡變性。腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性和脂肪變性，腎小球浸潤(rùn)大量的炎性細(xì)胞。腺胃腺體上復(fù)管狀有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。氣管黏膜廣泛水腫，黏膜上皮增厚，上皮細(xì)胞脫落。 5．采用氣管環(huán)組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行血清學(xué)中和實(shí)驗(yàn)，取PF株、GZ株(本課題分離鑒定的分離株)與Y

6、X株、Mass標(biāo)準(zhǔn)毒株和PT毒株進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明：GZ毒株與Yx毒株、PT毒株、PF毒株是屬于同一血清型的不同亞型，GZ毒株與Mass毒株是關(guān)系甚遠(yuǎn)的變異型或不同于Mass毒株的一個(gè)獨(dú)立的血清型。PF毒株與PT毒株、GZ毒株屬于同一血清型的不同亞型，與YX毒株、Mass毒株是屬于不同的血清型。實(shí)驗(yàn)表明，五株病毒株都存在有一定的抗原相關(guān)性，且抗原相關(guān)有一定程度的不對(duì)稱。同時(shí)說(shuō)明，PF分離株和GZ分離株屬于傳染性支氣管炎病毒。

7、 6．GZ分離株3CL基因的核苷酸序列推導(dǎo)氨基酸序列分析與比較：GZ株的3CL基因片段在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上，暫時(shí)與Beaudtte株處于同一個(gè)分支；3CL<'pro>基因的核苷酸序列和氨基酸序列與國(guó)內(nèi)分離的腎病變型毒株分屬于不同的系統(tǒng)進(jìn)化分支；3CL<'pro>基因的核苷酸序列和氨基酸序列與Beaudtte株的相關(guān)位點(diǎn)變化趨勢(shì)比較一致。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析來(lái)看，核苷酸序列或氨基酸序列同源性高的，其致病型并不一致。比如GZ株與Beaudtte株