禽傳染性支氣管炎病毒基因雙順?lè)醋覦NA疫苗及mRNA3的分子特性研究.pdf

1、1、本研究采用PCR擴(kuò)增獲取雞的IL-2、IL-18基因，將其插入pMD18-T載體中進(jìn)行測(cè)序鑒定。對(duì)含有S1、M、N目的基因的pIBVS1、pIBVM、pIBVN質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果表明，IL-2、IL-18、S1、M、N基因全長(zhǎng)分別為432bp、536bp、1671bp、678bp和1230bp，鑒定的目的基因正確。以pDsRed-Express-N1載體為骨架，以內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internalribosomeentrysi

2、te)序列為連接元件構(gòu)建綠色和紅色熒光基因的雙順?lè)醋颖磉_(dá)質(zhì)粒pIRES-EGFP/Red，轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后觀察到綠色和紅色熒光基因均獲得表達(dá)。構(gòu)建的pIRES-EGFP/Red載體含有卡那霉素抗性基因，比含有氨芐抗性的雙順?lè)醋虞d體具有更高的生物安全性，為今后開展各種病原微生物雙順?lè)醋覦NA疫苗的研制提供研究工具。 2、用S1、M、N基因與IL-2、IL-18基因分別替換pIRES-EGFP/Red質(zhì)粒中的熒光基因，構(gòu)建雙順?lè)醋?/p>

3、表達(dá)質(zhì)粒pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18和pIRES-N/IL18及其單基因表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，利用RT-PCR及間接免疫熒光檢測(cè)質(zhì)粒在體外的表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)表明轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的Vero細(xì)胞中均能特異的擴(kuò)增出S1、M、N和(或)IL-2、IL-18基因片段；間接免疫熒光檢測(cè)表明，轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的細(xì)胞顯示出黃綠色熒光，而轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒

4、的細(xì)胞則沒(méi)有顯示出任何特異熒光。本研究為IBV結(jié)構(gòu)基因和細(xì)胞因子雙順?lè)醋覦NA疫苗免疫試驗(yàn)提供了材料。 3、采用本課題組獲得專利(專利號(hào)為200410081443.4)的質(zhì)粒提取、純化方法制備質(zhì)粒，將質(zhì)粒溶液(1mg/mL)與脂質(zhì)體溶液(10mg/mL)等體積混合配制成DNA疫苗。將配制的DNA疫苗通過(guò)腿部肌肉多點(diǎn)注射7日齡非免疫雛雞，28日齡加強(qiáng)免疫一次。分別在免疫前和免疫后7、14、21、28、35d采血檢測(cè)ELISA抗體效

5、價(jià)和外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量。二免后兩周用IBV強(qiáng)毒進(jìn)行攻毒。ELISA抗體水平結(jié)果顯示：pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2疫苗組產(chǎn)生的抗體水平高于pIRES-S1、pIRES-M、pIPES-N疫苗組，在免疫后14-35d，差異顯著(P＜0.05);pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18疫苗組產(chǎn)生的抗體水平也高于pIPES-M、pIRES-N疫苗組，在免疫

6、后14-35d，差異顯著(P＜0.05)，pIRES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗組產(chǎn)生的抗體水平與pIRES-S1+plRES-IL2、pIPES-S1+pIRES-IL18疫苗組相比在免疫后21-35d差異顯著(P＜0.05)；外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量檢測(cè)結(jié)果顯示：pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2疫苗組在免疫后7-28d，與pIRES-S1、pIRE

7、S-M、pIPES-N疫苗組相比差異顯著(P＜0.05)，pIRES-S1/IL18、pIPES-M/IL18、pIRES-N/IL18疫苗組在免疫后14-28dCD3+、CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量高于pIRES-S1、pIRF-M、pIPES-N疫苗組，差異顯著(P＜0.05)。pIPES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗組的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量較pIRES-S1+pIRES-IL2

8、、pIRES-S1+pIRES-IL18DNA疫苗組高，但差異不顯著(P＞0.05)。攻毒結(jié)果表明，雙順?lè)醋覦NA疫苗組的保護(hù)率介于65％～85％，其中RES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗組的保護(hù)率分別為85％和75％，高于混合質(zhì)粒pIRES-S1+pIRES-IL2、pIRES-S1+pIPES-IL18DNA疫苗組的70％和60％。其中pIRES-S1/IL2疫苗組的保護(hù)率85％高于滅活疫苗組的攻毒保護(hù)率75％。本研

9、究研制出的IBV結(jié)構(gòu)蛋白與IL-2、IL-18雙順?lè)醋覦NA疫苗，為提高IBVDNA疫苗的免疫效率提供了新的途徑。 4、采用RT-PCR獲取IBVE基因，用以替換pIRES-M/Red質(zhì)粒中的紅色熒光基因，構(gòu)建雙順?lè)醋颖磉_(dá)質(zhì)粒pIRES-M/E，轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)。采用本論文第三章的方法制備DNA疫苗和進(jìn)行動(dòng)物免疫試驗(yàn)。結(jié)果表明：在免疫后7-35d，pIPES-M/E免疫組產(chǎn)生的抗體水平及外周血T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量高于

10、pIRES-M組，但差異不顯著(P＞0.05)；pIRES-M/E、pIRES-M組對(duì)強(qiáng)毒的攻擊保護(hù)率分別為55％和40％，且低于滅活疫苗的攻毒保護(hù)率(75％)。本研究構(gòu)建了IBV的M基因和E基因雙順?lè)醋覦NA疫苗并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了研究，結(jié)果初步認(rèn)為E基因?qū)基因免疫的協(xié)同作用不明顯。 5、采用RT-PCR方法對(duì)IBVmRNA3(3a3b3c)區(qū)域進(jìn)行了克隆、測(cè)序及分子特性分析，測(cè)序表明3a3b3c片段大小為734bp，包含完

11、整的3a、3b、3c(E)基因，與GenBank上公布的58株IBV毒株的相應(yīng)序列的同源率介于78.2％～96.1％之間，與CK/CH/LGD/04II毒株和CK/CH/LSC/99I毒株的同源率最高(96.1.％和95.9％)。對(duì)3a3b序列的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明兩者具有相同的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性存在差異。進(jìn)一步構(gòu)建3a3b的雙熒光基因共表達(dá)質(zhì)粒p3a3b-EGFP/Red，并對(duì)其IRES功能進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果沒(méi)能檢測(cè)