雞傳染性支氣管炎病毒基因型與血清型相關(guān)性初步研究.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于IBV基因組RNA復(fù)制的不連續(xù)性以及RNA聚合酶的不完全校對(duì)機(jī)制,基因組十分容易發(fā)生點(diǎn)突變、缺失、插入和不同毒株基因組間的同源重組等,使得病毒的基因型、血清型、結(jié)構(gòu)蛋白、免疫原性等容易發(fā)生變化

2、,造成病毒臨床表現(xiàn)復(fù)雜,各血清型之間僅有部分或完全沒有交叉保護(hù)作用,從而給本病的防治帶來很大的困難。IBV毒株的分型對(duì)于實(shí)施有效的疫病控制、流行病學(xué)調(diào)查及研究病毒的演化意義重大。本研究采用基因分型與血清學(xué)分型相結(jié)合的方法對(duì)國(guó)內(nèi)近年來所流行的毒株和疫苗株、檢驗(yàn)用毒株進(jìn)行分型,進(jìn)而判定兩者之間的相關(guān)性,更真實(shí)地反映其生物學(xué)特征,為目前雞傳染性支氣管炎病毒的分型提供一定的參考,有助于IB疫苗的正確使用,對(duì)今后雞傳染性支氣管炎的防治也有著積極的

3、意義。
　　 本研究以收集自國(guó)內(nèi)不同地區(qū)的17株IBV分離株、2株疫苗生產(chǎn)用毒株(M41、W93)和1株攻毒用強(qiáng)毒株X株為研究對(duì)象,采用自行設(shè)計(jì)特異性引物經(jīng)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到20株IBV的S1蛋白基因片段。將目的基因S1插入到pGEM-T Easy載體,重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定為陽性后,對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用DNAStar分析軟件的Clustal V方法將克隆測(cè)序的S1蛋白基因分別與GenBank中的20株國(guó)內(nèi)外參考毒株的S

4、1基因進(jìn)行序列比較和同源性分析,繪制S1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明:20株IBV毒株與我國(guó)IBV分離株、我國(guó)常用疫苗株以及國(guó)外參考毒株分為3個(gè)基因型。其中,第一個(gè)基因型為L(zhǎng)X4型,包含了本研究中從我國(guó)不同地區(qū)收集的14株IBV毒株(BJ-0,BJ-2,BJ-3,BJ-4,BJ-5,333-4,333-5,333-6,333-7,333-8,333-9,333-10,DC07-1,DC07-2),其中BJ-0、BJ-2、BJ-3、BJ-4、

5、BJ-5這5株的親緣關(guān)系均高于99.8％,333-4,333-5,333-6,333-7,333-8,333-9,333-10,DC07-2的親緣關(guān)系均高于99.3％,DC07-1與它們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),介于87.3～87.8％;第二個(gè)基因型為Mass型,包括本研究中的5株分離株333-1,333-2,333-3,M41,W93,我國(guó)常用IB疫苗株H52、H120和國(guó)外IBV分離株(西班牙、美國(guó)、韓國(guó)、日本等)。其中333-1,333-2

6、,333-3這3株之間的親緣關(guān)系均高于99.5％,W93與IBN株親緣關(guān)系較近,M41與Spain-98-308的親緣關(guān)系較近;第三個(gè)基因型為X型,本研究中的X株屬于該型,且X株與Ark99的親緣關(guān)系很近,同源性達(dá)97.8％。
　　 根據(jù)20株IBV毒株基因分型的結(jié)果,從S1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹中的三個(gè)基因群中分別選取差異性較大的6株IBV毒株,即X型的X株,Mass型中的M41、W93、333-3,LX4型中的DC07-1、333

7、-7株,進(jìn)行血清學(xué)分型試驗(yàn)。首先對(duì)其進(jìn)行純凈性檢驗(yàn),測(cè)定每株IBV的雞胚半數(shù)感染量(EID50),并免疫3周齡SPF雞制備高免血清,進(jìn)行血清交叉中和試驗(yàn),計(jì)算IBV各毒株間的抗原性的相關(guān)系數(shù)(R)。結(jié)果表明,6株IBV毒株是純凈的,不含其它微生物,各毒株的EID50均高于106.0EID50/0.1mL。經(jīng)免疫學(xué)方法計(jì)算,X型X株與Mass型的M41、W93、333-3的抗原性相關(guān)系數(shù)分別為:7％、14％、8％(＜25％),與LX4型的

8、DC07-1、333-7的抗原性相關(guān)系數(shù)分別為6％、9％(＜25％),說明X型的X株與Mass型的M41、W93、333-3,與LX4型的DC07-1、333-7分別屬于不同的血清型,X株與它們之間的抗原交叉較低;Mass型的333-3與同型的M41、W93的抗原性相關(guān)系數(shù)分別為97％、98％(＞80％),與LX4型的DC07-1、333-7的抗原性相關(guān)系數(shù)分別為8％、13％(＜25％),說明Mass型的333-3與同型的M41、W93

9、屬于同一個(gè)血清型,它們之間的抗原交叉較高,而與LX4型的DC07-1、333-7屬于不同的血清型,它們之間的抗原交叉較低;Mass型的M41與同型的W93的抗原性相關(guān)系數(shù)為35％(>25％),與LX4型的DC07-1、333-7的抗原性相關(guān)系數(shù)為7％、18％(＜25％),說明Mass型的M41與同型的W93屬于同一血清型,兩者之間的抗原交叉較高,而與LX4型的DC07-1、333-7的抗原交叉較低,屬于不同的血清型;Mass型的W93與

10、LX4型的DC07-1、333-7的抗原性相關(guān)系數(shù)分別為13％、18％(＜25％),說明它們屬于不同的血清型,它們之間的抗原交叉較低:LX4型的DC07-1與同型的333-7的抗原性相關(guān)系數(shù)為44％(＞25％),兩者之間的抗原交叉較高,屬于同一血清型。綜上可知:X型的X株與Mass型中M41、W93、333-3以及LX4型中的DC07-1、333-7分別屬于不同的血清型,而Mass型中M41、W93、333-3屬于相同的血清型,LX4型

11、中的DC07-1、333-7屬于相同的血清型。因此,6株IBV毒株經(jīng)血清交叉中和試驗(yàn)可分為三個(gè)血清型:333-3,M41,W93為同一血清型,DC07-1,333-7為同一血清型,X株為另外一個(gè)血清型。
　　 綜上,本試驗(yàn)對(duì)20株IBV毒株進(jìn)行了基因分型,根據(jù)S1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹選擇其中差異性較大的6株進(jìn)行血清交叉中和試驗(yàn),結(jié)果表明雞傳染性支氣管炎病毒的基因分型與血清分型相一致,初步證明了IBV的基因型與血清型存在一致性。這為目