CD99+-mCD99L2-調(diào)控H-RS細胞與B淋巴瘤細胞轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)組學研究及相關通路分析.pdf

1、研究背景和目的:
　　 霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma，HL)是惡性淋巴瘤的一大類型，具有特征性的腫瘤細胞H/RS（Hodgkin/Reed-Steinberg）細胞，但H/RS細胞一般僅占腫瘤組織的極少部分(＜1％)，其余是大量以T淋巴細胞為主的炎性反應背景細胞，且經(jīng)常發(fā)生變異，造成診斷上的困難。要把握H/RS的本質(zhì)，就必須清楚H/RS細胞是如何發(fā)生、發(fā)展，與背景細胞之間究竟存在怎樣復雜的相互關系，而要從根本上探

2、究這些問題，迫切需要類似人HL病理特征的實驗動物模型。目前雖然存在諸多人源性H/RS細胞株，但成瘤實驗罕見報道，因為研究顯示運用人H/RS細胞株時往往需要免疫嚴重缺陷的實驗鼠如SCID、BNX或NOG鼠才能成瘤，但是越是免疫缺陷則越不能反映該腫瘤具有豐富免疫背景及炎癥特性。因此構(gòu)建鼠源性的H/RS細胞來構(gòu)建鼠源性的動物模型成為研究的一個長期設想。
　　 Küppers等研究者發(fā)現(xiàn)H/RS細胞來源于生發(fā)中心的殘疾B細胞，認為生發(fā)中

3、心B細胞在成熟過程中，一部分細胞經(jīng)歷了有利的突變選擇，被T輔助及濾泡樹突狀細胞所選擇，經(jīng)過反復的增生、突變和選擇，陽性選擇細胞分化為漿細胞及記憶B細胞;而另一部分GCB細胞經(jīng)過不利的突變，如反義突變、自身反應性的獲得等成為功能上殘缺的所謂前凋亡細胞，并經(jīng)歷了程序性細胞死亡。一些殘缺的前凋亡細胞丟失了被抗原選擇的能力，從而沒有經(jīng)歷正常的凋亡過程，成為H/RS前體細胞。H/RS細胞在克隆過程中其B細胞表面標志部分或全部消失，出現(xiàn)CD15、C

4、D30特征性抗原標記物，成為H/RS細胞的生物學特性之一。由于H/RS細胞免疫表型及受體的改變，使其逃避免疫監(jiān)視和細胞凋亡而得以生存及克隆性增殖。
　　 人CD99是一個糖基化跨膜蛋白，研究發(fā)現(xiàn)CD99的下調(diào)與人H/RS細胞的形成有關。本研究組前期通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CD99基因表達陰性的HL細胞株L428，篩選穩(wěn)定表達CD99的L428-CD99細胞亞系，初步證實L428-CD99細胞亞系重現(xiàn)部分B細胞特征;同時發(fā)現(xiàn)鼠源性CD99（

5、mouseCD99antigen-like2，mCD99L2）和CD99高度同源，通過慢病毒ShRNA質(zhì)粒LV-mCD99L2轉(zhuǎn)染內(nèi)源性mCD99L2基因表達陽性的B淋巴瘤細胞株A20，篩選穩(wěn)定表達干擾質(zhì)粒的LV-mCD99L2-A20細胞亞系，初步證實有些LV-mCD99L2-A20細胞和人H/RS細胞有相似特征。
　　 本研究擬在構(gòu)建穩(wěn)定表達人CD99基因的L428亞系和穩(wěn)定干擾鼠CD99基因的鼠B淋巴瘤A20細胞亞系的基礎

6、上，利用熒光差異凝膠雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)分別比較兩種處理前后的細胞株蛋白表達差異，分離與鑒定與人、鼠CD99相互作用的靶蛋白，通過生物信息學研究分析方法得到的人、鼠兩組數(shù)據(jù)，篩選出在細胞轉(zhuǎn)化中起重要作用的蛋白，分析驗證其功能及可能涉及的信號通路，為進一步闡明mCD99L2相互作用蛋白在構(gòu)建H/RS細胞模型和類人HL動物模型中的作用和意義提供理論依據(jù)。
　　 研究內(nèi)容與方法:
　　 一、L428-CD99和LV-mCD9

7、9L2-A20細胞亞系的鑒定及分析
　　 1.L428-CD99細胞亞系的鑒定
　　 對前期構(gòu)建的穩(wěn)定過表達CD99基因的L428-CD99克隆株反復傳代培養(yǎng)，利用RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR、Westernblot檢測CD99mRNA和蛋白表達;通過光鏡觀察、細胞計數(shù)和鬼筆環(huán)肽染色檢測CD99基因過表達對L428細胞形態(tài)大小以及細胞骨架蛋白的影響;利用MTT實驗檢測CD99基因過表達對L428細胞增殖能力的影

8、響;利用免疫細胞化學和流式細胞檢測相關抗原標記分析CD99基因上調(diào)對L428細胞分化相關蛋白的影響。
　　 2.LV-mCD99L2-A20細胞亞系的鑒定
　　 對前期篩選出的穩(wěn)定干擾mCD99L2基因表達的LV-mCD99L2-A20細胞株反復傳代培養(yǎng)，利用載體上通用引物進行PCR檢測干擾載體整合至LV-mCD99L2-A20細胞情況;利用RT-PCR檢測目的基因片段mCD99L2的mRNA表達，通過實時熒光定量RT-

9、PCR檢測mCD99L2基因的干擾效率;鏡下觀察觀察mCD99L2干擾對A20細胞形態(tài)大小的影響，利用MTT實驗檢測mCD99L2干擾對A20細胞增殖能力的影響。
　　 二、CD99+/mCD99L2-調(diào)控H/RS細胞與B淋巴瘤細胞轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)組學分析
　　 運用熒光差異雙向凝膠電泳技術(shù)分別對人鼠兩組轉(zhuǎn)化細胞（人源性L428-CD99細胞/空載體轉(zhuǎn)染的L428-CTR細胞和鼠源性LV-mCD99L2-A20和空載體轉(zhuǎn)染的

10、LV-Gus-A20細胞）進行蛋白分離得到差異蛋白凝膠電泳圖，結(jié)合軟件分析和手工篩選，與制備膠匹配后，挖取了差異蛋白質(zhì)點，采用靈敏且高通量的肽質(zhì)量指紋圖譜蛋白質(zhì)鑒定方法鑒定差異蛋白，進一步采用GOfact開放軟件進行在線聚類分析(http://www.hupo.org.cn/gofact)，對所得差異蛋白所參與的生物過程、所參與構(gòu)成的細胞組件、所介導的分子功能進行注釋，分析和細胞轉(zhuǎn)化相關的蛋白。
　　 三、CD99+/mCD99

11、L2-調(diào)控H/RS細胞與B淋巴瘤細胞轉(zhuǎn)化的差異蛋白篩選及初步驗證
　　 1.篩選差異蛋白并分析
　　 通過生物信息學檢索預測CD99和mCD99L2相互作用的蛋白，結(jié)合雙向熒光凝膠電泳和質(zhì)譜分析得到的人鼠兩組差異蛋白，篩選分析人CD99+/鼠mCD99L2-調(diào)控H/RS細胞與B淋巴瘤細胞轉(zhuǎn)化的差異蛋白。
　　 2.篩選蛋白在人細胞、組織上的表達驗證
　　 利用實時熒光定量RT-PCR、免疫細胞化學、Wes

12、ternblot和免疫熒光共聚焦檢測篩選差異蛋白在人H/RS細胞轉(zhuǎn)化細胞(L428-CD99和L428-CTR)和病理組織中的mRNA和蛋白表達。
　　 3.篩選蛋白在鼠源性細胞上的表達驗證
　　 利用免疫細胞化學、Westernblot檢測篩選差異蛋白在LV-mCD99L2-A20和LV-Gus-A20細胞中表達。
　　 四、差異蛋白Septin-2在L428細胞和B淋巴瘤細胞初步功能驗證及相關信號通路分析

13、r>　　 1、Septin-2蛋白與H/RS細胞和B淋巴細胞調(diào)控因子的關系
　　 信息學分析、westernblot檢測驗證Septin-2與調(diào)控因子nf-kappaB和c-Myb的關系。
　　 2、Septin-2在H/RS細胞和B淋巴瘤細胞轉(zhuǎn)化中初步功能驗證
　　 瞬時干擾L428細胞中Septin-2表達，通過鏡下觀察、熒光共聚焦檢測、CCK8實驗和流式細胞檢測Septin-2基因干擾對L428細胞形態(tài)、

14、細胞骨架蛋白、細胞增殖能力和免疫表型的影響。
　　 3、Septin-2在H/RS細胞和B淋巴瘤細胞轉(zhuǎn)化中可能參與的信號通路分析
　　 采用Westernblot檢測H/RS細胞L428穩(wěn)定過表達CD99基因前后及瞬時干擾Septin-2基因前后相關通路蛋白的表達;結(jié)合蛋白組學分析結(jié)果，通過生物信息學和文獻資料分析Septin-2在CD99調(diào)控H/RS細胞向B淋巴瘤細胞轉(zhuǎn)化中可能參與的信號調(diào)控通路。
　　 結(jié)果:

15、
　　 一、L428-CD99和LV-mCD99L2-A20細胞亞系的鑒定及分析
　　 1.L428-CD99細胞亞系的鑒定
　　 (1)RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR和Westernblot檢測顯示，與空載體組比較，L428-CD99細胞亞系CD99基因和蛋白表達均增高。
　　 (2)培養(yǎng)細胞鏡下形態(tài)觀察、HE染色后計數(shù)，L428-CD99細胞亞系細胞體積變小，差異具有顯著性(t=7.131，P

16、=0.018);鬼筆環(huán)肽染色發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，L428-CD99細胞骨架發(fā)生重建。
　　 (3)MTT檢測發(fā)現(xiàn)，CD99基因過表達組較空載體組增殖減慢，差異具有顯著性(F=773.374，P=0.000);
　　 (4)免疫細胞化學和流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)，CD99基因過表達后，與對照組相比，CD30、CD15和MUM1表達降低，CD10、CD19、CD79α、BCL-6、PAX5和CD38表達增高，而CD20和CD138的

17、表達沒有明顯改變。
　　 2.LV-mCD99L2-A20細胞亞系的鑒定
　　 (1)PCR檢測干擾載體穩(wěn)定整合于LV-mCD99L2-A20細胞基因組，RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR檢測LV-mCD99L2-A20細胞中目的基因片段mCD99L2的mRNA表達穩(wěn)定降低，mCD99L2基因的干擾效率約51％。
　　 (2)傳代培養(yǎng)細胞于倒置顯微鏡下和HE染色發(fā)現(xiàn)，LV-mCD99L2-A20細胞細胞體積明

18、顯增大，出現(xiàn)類人H/RS細胞的巨大細胞;MTT實驗檢測mCD99L2干擾使A20細胞增殖能力下降，差異具有顯著性(F=77.452，P=0.000)。
　　 二、CD99+/mCD99L2-調(diào)控H/RS細胞與B淋巴瘤細胞轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)組學分析
　　 1.人源性轉(zhuǎn)化細胞組熒光差異雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析
　　 人源性轉(zhuǎn)化細胞組通過熒光差異雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析得到38個差異蛋白，與L428-CD99細胞而言正相關的蛋白

19、21個，負相關的蛋白17個。其中RhoGDP-dissociationinhibitor2（GDIR2）和Septin-2(SEPT2)參與細胞骨架;DNAmismatchrepairproteinMsh2(MSH2),Hematopoieticlineagecell-specificprotein(HS1)參與細胞分化;RhoGDP-dissociationinhibitor2(GDIR2)、ProstaglandinEsynthas

20、e3(TEBP)、Prohibitin(PHB)、Hematopoieticlineagecell-specificprotein(HS1)、Sorcin(SORCN)和GEM-interactingprotein(GMIP)參與信號通路;Prohibitin(PHB)、Heatshockproteinbeta-1(HSPB1)和Hematopoieticlineagecell-specificprotein(HS1)參與調(diào)節(jié)基因表達。

21、
　　 2.鼠源性轉(zhuǎn)化細胞組熒光差異雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析
　　 鼠源性轉(zhuǎn)化細胞組通過熒光差異雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析得到41個差異蛋白，其中與LV-mCD99L2-A20細胞而言正相關的蛋白21個，負相關的蛋白20個。其中參與細胞骨架的蛋白有Actin，cytoplasmic1(ACTB)、Septin-2(SEPT2)、PDZandLIMdomainprotein1(PDLI1)，Stathmin(STMN1);參與細

22、胞分化的蛋白有stathmin(STMN1)、ADP-ribosylationfactor-likeprotein6（ARL6）;參與信號通路的蛋白有RanGTPase-activatingprotein1(RAGP1)、ADP-ribosylationfactor-likeprotein6（ARL6）;參與調(diào)節(jié)基因表達的蛋白有Eukaryotictranslationinitiationfactor4E(IF4E)、Nucleopho

23、smin(NPM)、60kDaheatshockprotein,mitochondrial(CH60)、PDZandLIMdomainprotein1(PDLI1)、Hypermethylatedincancer2protein(HIC2)、Poly(U)-binding-splicingfactorPUF60(GCP60)等。
　　 三、CD99+/mCD99L2-調(diào)控H/RS細胞與B淋巴瘤細胞轉(zhuǎn)化差異蛋白篩選及驗證
　

24、　 1.通過生物信息學檢索和人鼠兩組轉(zhuǎn)化細胞差異蛋白的分析比較，選取骨架蛋白Septin-2和Stathmin作為驗證的目標蛋白。
　　 2.實時熒光定量RT-PCR、免疫細胞和細胞化學、Westernblot和熒光共聚焦檢測顯示Septin-2和Stathmin的mRNA水平、蛋白水平在人轉(zhuǎn)化細胞組L428和L428-CD99中存在差異表達，蛋白水平在組織標本中也存在差異，Septin-2和CD99表達負相關，Stathmi

25、n和CD99表達正相關。
　　 3.免疫細胞化學、Westernblot檢測顯示Septin-2和Stathmin在鼠源性轉(zhuǎn)化細胞A20和LV-mCD99L2-A20中存在差異表達，與人源性轉(zhuǎn)化細胞上表達一致。
　　 四、差異蛋白Septin-2在L428細胞和B淋巴瘤細胞初步功能驗證及相關信號通路分析
　　 1.Septin-2上游調(diào)控因子NF-kappaB1、c-Myb和XBP-1也是促進H/RS細胞形成和B

26、細胞分化的調(diào)控因子。Westernblot檢測顯示NF-kappaB1和c-Myb參與H/RS細胞和B淋巴細胞的轉(zhuǎn)化，Septin-2的表達受nf-kappaB、c-Myb調(diào)控，與nf-kappaB表達呈正相關，與c-Myb表達呈負相關;nf-kappaB和c-Myb不受Septin-2的調(diào)控。
　　 2.倒置顯微鏡下連續(xù)觀察和熒光共聚焦檢測顯示L428瞬時干擾SEPT2后細胞骨架發(fā)生重建，細胞偽足狀突起消失。
　　 3

27、.CCK8試驗顯示與空載體組L428-cn細胞相比，L428-sisept2細胞株生長較緩慢，差異具有顯著性(F=204.927，P=0.000)。
　　 4.流式細胞檢測結(jié)果顯示L428細胞瞬時干擾Septin-2后細胞的部分抗原標記出現(xiàn)了小幅改變，H/RS細胞特征性抗原標記CD30和CD15表達下降，B細胞抗原標記CD19表達上升，生發(fā)中心標記CD10和早期漿細胞標記CD38表達也有上升。
　　 5.Westernb

28、lot檢測發(fā)現(xiàn)，干擾L428中Septin-2和過表達L428中CD99表達，RhoA蛋白表達都明顯降低;結(jié)合RhoGDI2、HS1、Stathmin等差異蛋白和信息學檢索，提出CD99調(diào)控H/RS細胞和B淋巴瘤細胞轉(zhuǎn)化過程中，可能通過上調(diào)RhoGDI2來抑制RhoFamilyGTPases信號通路中的RhoGTP酶，主要是抑制了RhoA活性，從而抑制細胞骨架GTP結(jié)合蛋白Septin-2的表達，促使骨架重建并抑制了細胞的增殖活性;同時

29、Septin-2也能通過調(diào)節(jié)RhoA蛋白參與B細胞受體通路，和HS1共同平衡轉(zhuǎn)化細胞的骨架重組，參與調(diào)節(jié)B細胞轉(zhuǎn)錄因子和B細胞抗原的形成分化。另一骨架蛋白Stathmin可能起到協(xié)同改變細胞骨架和形態(tài)作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.前期構(gòu)建L428-CD99和LV-mCD99L2-A20細胞亞系反復傳代培養(yǎng)并驗證CD99+/mCD99L2-調(diào)控了H/RS細胞與B淋巴瘤細胞的轉(zhuǎn)化;
　　 2.人H/RS細胞株L42

30、8過表達CD99后得到38個差異蛋白，21個表達上調(diào)，17個表達下調(diào);鼠源性B淋巴瘤細胞株A20敲低mCD99L2表達后得到41個差異蛋白，21個表達上調(diào)，20個表達下調(diào);部分蛋白參與細胞分化、信號通路、骨架改變和基因表達調(diào)節(jié)等功能，和細胞轉(zhuǎn)化密切相關;
　　 3.骨架蛋白Septin-2和Stathmin在人鼠兩組轉(zhuǎn)化細胞中皆存在差異表達，Septin-2與CD99表達負相關，Stathmin與CD99表達正相關;
　　

31、 4.初步驗證了Septin-2在人H/RS細胞轉(zhuǎn)化中通過骨架重建參與細胞形態(tài)改變，降低細胞增殖活性，參與H/RS細胞向B淋巴瘤細胞轉(zhuǎn)化過程中的抗原分化;分析其可能主要通過RhoFamilyGTPases信號通路和B細胞受體的信號通路發(fā)揮作用。
　　 創(chuàng)新之處
　　 1.本研究通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選CD99+/mCD99L2-調(diào)控了H/RS細胞與B淋巴瘤細胞轉(zhuǎn)化的差異蛋白，分析出一批和轉(zhuǎn)化密切相關的蛋白;