A20-LV-mCD99L2-A20鼠淋巴瘤動(dòng)物模型的構(gòu)建與HL.pdf

1、目的: 1、鑒定低表達(dá)mCD99L2的LV-mCD99L2-A20細(xì)胞亞系，以探究mCD99L2基因在HL的H/RS細(xì)胞形成中的作用，并為后續(xù)模型動(dòng)物的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。 2、鼠源性B淋巴瘤細(xì)胞株A20以不同方式接種同源BALB/c小鼠，構(gòu)建有免疫功能的鼠B淋巴瘤動(dòng)物模型，探討不同造模方式的優(yōu)劣，為本研究后續(xù)工作奠定基礎(chǔ)，并為B淋巴瘤相關(guān)研究提供適合的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。 3、將LV-mCD99L2-A20細(xì)胞亞系接種BALB

2、/c小鼠，進(jìn)行成瘤情況觀察、病理形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定和免疫標(biāo)記的檢測(cè)，探討成瘤特點(diǎn)、成瘤組織病變特征與A20動(dòng)物模型之間的差異及與HL之間的關(guān)系。 4、借助生物信息學(xué)軟件對(duì)HL與細(xì)胞因子相關(guān)性進(jìn)行檢索和分析。利用蛋白芯片初步檢測(cè)A20/LV-mCD99L2-A20細(xì)胞和BALB/c成瘤組織中細(xì)胞因子的表達(dá)、及差異，尋找LV-mCD99L2-A20細(xì)胞模型、動(dòng)物模型與構(gòu)建類人HL動(dòng)物模型之間關(guān)系的相關(guān)依據(jù)。 方法:

3、 1、LV-mCD99L2-A20細(xì)胞亞系的鑒定對(duì)前期構(gòu)建的慢病毒質(zhì)粒穩(wěn)定干擾的LV-mCD99L2-A20克隆株進(jìn)行體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡、HE染色觀察LV-mCD99L2-A20細(xì)胞的形態(tài)變化并進(jìn)行計(jì)數(shù)，隨機(jī)選擇多代細(xì)胞進(jìn)行DNA-PCR檢測(cè)ShRNA干擾載體的整合，RT-PCR及熒光定量PCR檢測(cè)目的基因mCD99L2的表達(dá)水平，免疫熒光觀察mCD30分子標(biāo)記，MTT法觀察細(xì)胞體外增殖能力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞的免疫表

4、型(CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD30)。 2、五種方式構(gòu)建有免疫功能A20鼠B淋巴瘤動(dòng)物模型將鼠源性B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株A20經(jīng)皮下接種、尾靜脈注射、脾臟注射、腹腔注射于同源BALB/c小鼠和A20接種裸鼠成瘤組織移植BALB/c小鼠，觀察動(dòng)物成瘤時(shí)間、成瘤率、皮下腫瘤生長速度、內(nèi)臟成瘤播散部位；取動(dòng)物臟器行石蠟包埋、制備病理切片、HE染色觀察病理學(xué)形態(tài)；運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其瘤組織細(xì)胞懸液中CD3、CD4、CD

5、8、CD19、CD30的表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)正常BALB/c小鼠、接種成瘤小鼠和未成瘤小鼠外周血中淋巴細(xì)胞亞群的比例。 3、LV-mCD99L2-A20鼠淋巴瘤動(dòng)物模型的構(gòu)建將經(jīng)過鑒定的低表達(dá)mCD99L2基因的LV-mCD99L2-A20細(xì)胞亞系經(jīng)皮下接種、尾靜脈注射和裸鼠成瘤組織塊移植的方法接種BALB/c小鼠，觀察動(dòng)物成瘤情況；取動(dòng)物臟器行石蠟包埋、病理切片、HE染色觀察病理學(xué)形態(tài)；計(jì)數(shù)成瘤切片中H/RS樣細(xì)胞；免疫熒光檢

6、測(cè)瘤組織mCD30分子標(biāo)記；運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其瘤組織細(xì)胞懸液中CD3、CD4、CD8、CD19、CD30的表達(dá)。腫瘤組織進(jìn)行原代培養(yǎng)，DNA-PCR檢測(cè)載體的整合，RT-PCR檢測(cè)mCD99L2基因mRNA水平。流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血和脾臟中淋巴細(xì)胞亞群的比例。 4、A20/LV-mCD99L2-A20體內(nèi)外細(xì)胞因子表達(dá)蛋白芯片初步檢測(cè)運(yùn)用生物信息學(xué)軟件GeneClip對(duì)HL和62種細(xì)胞因子進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。運(yùn)用

7、小鼠細(xì)胞因子功能分類蛋白芯片(RayBiotechmousecytokineAntibodyArrays)對(duì)A20細(xì)胞和LV-mCD99L2-A20細(xì)胞、A20細(xì)胞BALB/c皮下成瘤組織和LV-mCD99L2-A20細(xì)胞BALB/c鼠皮下成瘤組織進(jìn)行蛋白質(zhì)抽提、蛋白質(zhì)定量，膜封閉和孵育、62種小鼠細(xì)胞因子檢測(cè)、圖像采集和數(shù)據(jù)分析，對(duì)差異細(xì)胞因子進(jìn)行初步分析。 結(jié)果: 1、LV-mCD99L2-A20細(xì)胞亞系的鑒定

8、 (1)傳代過程中倒置顯微鏡觀察和HE染色均發(fā)現(xiàn)LV-mCD99L2-A20細(xì)胞中存在類似H/RS細(xì)胞的大細(xì)胞。隨機(jī)抽取A、B、C、D代LV-mCD99L2-A20細(xì)胞計(jì)數(shù)其中的大細(xì)胞發(fā)現(xiàn)較A20細(xì)胞中的大細(xì)胞多，差異有顯著性(P<0.05)。 (2)抽提多代LV-mCD99L2-A20細(xì)胞DNA進(jìn)行PCR均能檢測(cè)出ShRNA干擾載體穩(wěn)定整合至A20細(xì)胞基因組。 (3)RT-PCR及熒光定量PCR檢測(cè)目的基因mCD99

9、L2均較A20細(xì)胞呈低水平表達(dá)，干擾效率約為50％。 (4)MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LV-mCD99L2-A20細(xì)胞體外增殖能力較對(duì)照A20組和空載體組減慢，差異有顯著性(P<0.05)。 (5)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)LV-mCD99L2-A20細(xì)胞S期比例與A20細(xì)胞無顯著性差異(P>0.05)，但是G2期較A20細(xì)胞長，差異有顯著性(P<0.05)。 (6)免疫熒光檢測(cè)LV-mCD99L2-A20細(xì)胞及其中的大細(xì)胞

10、CD30呈陽性表達(dá)。 (7)LV-mCD99L2-A20細(xì)胞的CD3表達(dá)(7.47±1.27％)較A20細(xì)胞(18.93±3.87％)降低，CD8表達(dá)(8.33±3.89％)較A20細(xì)胞(18.27±3.45％)降低，CD20表達(dá)(13.10±5.16％)較A20細(xì)胞(35.33±2.25％)降低，CD30表達(dá)(76.0±12.44％)較對(duì)照A20細(xì)胞(41.70±2.60％)升高，差異有顯著性(n=3，P<0.05)，而CD4

11、、CD19差異不顯著(P>0.05)?？蛰d體組與對(duì)照A20細(xì)胞CD抗原表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。 2、五種方式構(gòu)建有免疫功能A20鼠B淋巴瘤動(dòng)物模型 (1)皮下成瘤：BALB/c小鼠皮下注射2×105組(n=7)未成瘤，2×106組(n=7)、2×107組(n=7)和裸鼠瘤組織移植BALB/c小鼠組(n=7)成瘤率皆為100％，成瘤時(shí)間分別為15.29±3.2天、7.0±0.82天、6.29±0.49天。

12、(2)內(nèi)臟成瘤：BALB/c小鼠尾靜脈注射2×106組、2×107組、脾臟注射組、腹腔注射組成瘤率分別為71.4％(5/7)、100％(7/7)、71.4％(5/7)、14.3％(1/7)，成瘤時(shí)間分別為76.8±12.0天、26.1±7.99天、32.6±5.99天和27天。尾靜脈成瘤部位播及肝臟、脾臟、胰腺、腎臟、食道、胃、腸、腸系膜、腦、淋巴結(jié)、骨、子宮、肌肉等多臟器和組織。 (3)BALB/c鼠A20成瘤組織鏡下觀察：瘤

13、細(xì)胞呈彌漫性分布，大小一致，細(xì)胞核大、圓形或不規(guī)則形，核仁明顯，胞質(zhì)中等量、嗜堿性，類似人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤。 (4)流式細(xì)胞儀檢測(cè)成瘤組織細(xì)胞懸液(n=8)CD3、CD4、CD8、CD19、CD30的表達(dá)陽性細(xì)胞比例分別為(％)：49.27±23.75、6.07±3.65、51.2±23.1、67.06±16.39、37.93±17.03。 (5)流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群 3、LV-mCD99L2-A2

14、0鼠淋巴瘤動(dòng)物模型的構(gòu)建 (1)LV-mCD99L2-A20接種后成瘤情況 (2)病理形態(tài)： (3)BALB/c小鼠瘤組織原代培養(yǎng) (4)流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群 (5)脾臟淋巴細(xì)胞亞群 4、A20/LV-mCD99L2-A20細(xì)胞和組織細(xì)胞因子表達(dá)的蛋白芯片初步檢測(cè) 結(jié)論: 1、LV-mCD99L2-A20細(xì)胞亞系中存在類似人H/RS細(xì)胞形態(tài)的H/RS樣細(xì)胞，LV

15、-mCD99L2-A20細(xì)胞在增殖能力、細(xì)胞周期和免疫表型方面較類似人HL。 2、A20細(xì)胞BALB/c小鼠皮下移植瘤模型成瘤時(shí)間短、尾靜脈接種形成的血行播散性模型成瘤部位廣泛，均為研究有免疫功能鼠B淋巴瘤適宜的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。 3、LV-mCD99L2-A20細(xì)胞較A20細(xì)胞在BALB/c鼠難以成瘤，但在成瘤組織中出現(xiàn)似人HL的H/RS樣細(xì)胞，伴有一定程度的背景淋巴細(xì)胞的浸潤。 4、LV-mCD99L2-A20細(xì)

16、胞較A20細(xì)胞上調(diào)了一些與報(bào)道中的HL或H/RS細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子；LV-mCD99L2-A20細(xì)胞與A20細(xì)胞在BALB/c小鼠體內(nèi)成瘤組織中細(xì)胞因子表達(dá)不同。 創(chuàng)新之處： 本研究從體外實(shí)驗(yàn)、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)和BALB/c鼠成瘤實(shí)驗(yàn)三個(gè)水平，從形態(tài)學(xué)、免疫表型、生物學(xué)行為三個(gè)主要方面并結(jié)合小鼠免疫功能初步檢測(cè)和細(xì)胞因子表達(dá)蛋白芯片初步檢測(cè)，較為系統(tǒng)地對(duì)比了A20細(xì)胞與LV-mCD99L2-A20細(xì)胞在細(xì)胞模型之間、動(dòng)物模型