和厚樸酚調(diào)控PPARγ誘導3T3-L1前脂肪細胞分化的研究.pdf

1、目的:
　　近年來，肥胖與糖尿病的發(fā)病率有增無減。前脂肪細胞分化與2型糖尿病、肥胖、胰島素抵抗和心血管疾病的產(chǎn)生與發(fā)展有著密切聯(lián)系，所以研究前脂肪細胞的分化是國內(nèi)外的研究熱點。中醫(yī)藥對脂肪細胞分化的具有一定的影響和療效，這對于2型糖尿病、胰島素抵抗、肥胖和心血管疾病的防治及減輕其危害具有重要意義。近些年來有研究顯示和厚樸酚對2型糖尿病以及肥胖有可觀的療效，但具體的作用機制尚未明確。過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome

2、proliferatoractivativedreceptors，PPAR是核受體超家族成員，大量研究表明，PPARs與肥胖、糖尿病、心血管疾病以及腫瘤有密切關(guān)系，并成為防治上述疾病的重要靶標。PPAR有α、γ、δ三種亞型，他們的功能和分布各異。PPARγ主要分布在脂肪、脾、腎和結(jié)腸中，在脂肪合成與分解過程中起著關(guān)鍵的作用。特異性PPARγ配體已經(jīng)在臨床中廣泛應用，療效顯著，但其可能的副作用也是主要難題。尋找有效和副作用少PPARγ配體

3、是目前研究的熱點。3T3-L1前脂肪細胞（Swiss小鼠胚胎成纖維細胞）是體外研究脂肪細胞與脂質(zhì)代謝的理想細胞模型。和厚樸酚(Honokiol)，是中藥厚樸主要活性成分，具有行氣化濕、溫中止痛、降逆平喘之用。最早發(fā)現(xiàn)其具有抗自由基和脂質(zhì)過氧化的作用，隨后又有研究發(fā)現(xiàn)其有抗炎、抗腫瘤、抗菌、調(diào)理腸胃、抗糖尿病、保護心血管等藥理作用。近年來其在糖尿病方面的藥理活性越來越受重視，因此有必要深入探究和厚樸酚的作用機制，為治療糖尿病發(fā)現(xiàn)新的靶標。

4、文獻顯示，許多酚類化合物具有PPARs激活作用，但和厚樸酚是否具有直接結(jié)合PPARγ并激活PPARγ信號通路調(diào)控脂肪細胞分化尚無相關(guān)報導。
　　因此，本課題提出和厚樸酚可能通過靶向結(jié)合PPARγ調(diào)控3T3-L1前脂肪細胞分化。為了驗證這一假說，首先證實了和厚樸酚通過PI3K/Akt信號通路調(diào)控胰島素信號通路誘導3T3-L1前脂肪細胞分化成脂肪細胞。然后抑制PPARγ受體后檢測和厚樸酚誘導分化作用是否減弱。為進一步開發(fā)和研制以PPA

5、Rγ為靶標的中醫(yī)藥提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.和厚樸酚對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響
　　培養(yǎng)3T3-L1脂肪前體細胞，采用經(jīng)典的“雞尾酒”法誘導3T3-L1前脂肪細胞分化作為陽性對照組。分組為:對照組、和厚樸酚組、“雞尾酒”組、“雞尾酒”+和厚樸酚組。給予不同濃度的和厚樸酚進行干預，用MTT法檢測和厚樸酚對細胞活性的影響，選取合適的濃度進行下面的實驗。采用油紅染色檢測3T3-L1前脂肪細胞第8天分化程度;

6、同時檢測不同組間的甘油三酯水平;采用RT-PCR以及法檢測各組3T3-L1前脂肪細胞的相關(guān)基因表達差異。
　　2.和厚樸酚通過調(diào)節(jié)PPARγ促進3T3-L1前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化
　　實驗結(jié)果表明和厚樸酚促進3T3-L1前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化，用雙熒光素酶報告基因法檢測和厚樸酚對PPAR反應元件及PPARγ啟動子活性的影響，采用PPARγ拮抗劑GW9662抑制PPARγ的活性，同時給予和厚樸酚干預，檢測細胞內(nèi)的甘

7、油三酯含量，油紅0染色檢測3T3-L1前脂肪細胞的脂質(zhì)積聚，并測量各組間的OD值，采用RT-PCR以及QRT-PCR法檢測脂肪細胞脂肪標志性蛋白aP2以及轉(zhuǎn)錄因子PPARγ、CEBP/α等mRNA的表達，Western Blot檢測PPARγ，Glut4，P-Akt的蛋白表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.MTT結(jié)果顯示濃度在1-15μM和厚樸酚對細胞活性沒有影響，25μM以上濃度的和厚樸酚抑制細胞活性。和厚樸酚顯著增加前脂肪細

8、胞分化過程中脂質(zhì)的堆積，促進脂肪細胞標志性蛋白aP2和轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPα、Acrp30與G1ut4等mRNA水平，同時和厚樸酚增加PPARγ、P-Akt、Glut4蛋白的表達，其機制與促進PPARγ和C/EBPα mRNA與蛋白質(zhì)表達有關(guān)。
　　2.雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示和厚樸酚上調(diào)PPRE及PPARγ啟動子的活性。PPARγ拮抗劑GW9662作用3T3-L1前脂肪細胞后，和厚樸酚促進3T3-L1前脂肪細胞向成熟

9、脂肪細胞分化的作用明顯減弱。同時脂肪細胞標志性蛋白aP2和轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPαmRNA水平也明顯減弱。
　　結(jié)論:
　　1.和厚樸酚誘導3T3-L1前脂肪細胞向脂肪細胞分化，并促進細胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運，增加脂肪形成相關(guān)基因如PPARγ、Acrp30、C/EBPα、aP2的表達。
　　2.GW9662抑制PPARγ后，和厚樸酚促進3T3-L1前脂肪細胞分化的作用明顯減弱，可能因為GW9662與和厚樸酚競爭性結(jié)合P