酵母組蛋白H3K79L、H4K20L單突變及雙突變對Elp3功能和SSA3等表達的影響.pdf

1、目的:組蛋白修飾在基因表達調(diào)控等多種生物學過程中起著重要作用,是表觀遺傳中重要的調(diào)控機制之一。組蛋白乙?；?、甲基化等修飾對基因表達調(diào)控具有重要影響。現(xiàn)有研究結果顯示,酵母Elongator復合物是由6個亞基組成,作為具有組蛋白乙?；D移酶活性的復合體協(xié)助高度磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ參與SSA3,GAL1等基因的轉錄延伸過程。在體外去除HeLa細胞抽提物中的Elongator復合物可降低其轉錄染色質(zhì)模板的速率,也為人Elongator復合物

2、參與轉錄延伸提供了生化證據(jù)。已知酵母和人Elongator復合物組成高度保守,且功能極為相似,其催化亞基Elp3 C端的保守HAT活性核心,為Elongator行使功能所必需。生物信息學分析表明Elp3的N末端還有一個類似S-腺苷甲硫氨酸激酶的結構域,該結構域包含F(xiàn)e4S4簇,可結合S-腺苷甲硫氨酸,可能與甲基化反應有關,因而推測這個未知功能的催化結構域可能擁有組蛋白去甲基酶活性。Greenwood等研究表明Elongator無組蛋白去

3、甲基化酶活性,其Elp3 N端的FeS簇為Elongator保持結構完整性所必需。因此目前Elp3第二結構域的功能尚不清楚。
　　 組蛋白特定位點的()乙酰化、甲基化修飾對細胞的生長和基因的轉錄有重要影響。為研究組蛋白甲基化與Elp3功能和特定基因表達的關系,本文構建了酵母組蛋白H3K79或/和H4K20突變?yōu)榱涟彼岵?)伴隨Elp3缺失的三個突變菌株,運用酵母功能互補實驗以及基因表達分析體系以研究在基因組水平甲基化的改變對全長

4、和第二結構域缺失的酵母和人ELP3補償功能的影響,以便深入了解Elp3功能及其與組蛋白乙?；?、甲基化的關系。
　　 方法:運用定點突變技術獲得組蛋白特定甲基化位點(H3K79,H4K20)氨基酸突變的著絲粒型載體;通過Plasmid Shuffle實驗用突變組蛋白取代野生組蛋白得到的組蛋白H3/H4特定甲基化位點突變并伴隨酵母ELP3基因缺失的系列突變菌株;運用乙酸鋰轉化法將Elp3系列質(zhì)粒轉入系列組蛋白突變并伴隨ELP3缺失的

5、突變株;通過高溫、高鹽、咖啡因等敏感性實驗和SSA3、GAL1等基因表達的檢測,確定基因組水平甲基化位點突變對ELP3補償功能和SSA3、GAL1等基因表達的影響。
　　 結果:1、利用定點突變技術構建組蛋白特定甲基化位點(H3K79,H4K20)氨基酸突變的著絲粒型載體。
　　 2、運用Plasmid Shuffle技術獲得組蛋白的H3K79、H4K20單突變和雙突變?yōu)榱涟彼岬膃lp3△菌株。
　　 3、轉入全

6、長和第二結構域缺失的酵母和人ELP3至組蛋白突變elp3△菌株作功能互補和基因表達分析,結果表明特定組蛋白甲基化位點突變嚴重影響了hELP3對elp3△菌株生長缺陷和SSA3和GAL1延遲表達的補償功能,并使yELP3的補償功能明顯降低;第二結構域缺失的酵母和人ELP3幾乎無補償功能。
　　 4、在供試的各種條件下,轉入yELP3基因的H3K79單突變elp3△菌株生長不如H4K20單突變elp3△菌株,而H4K20單突變elp

7、3△菌株生長不如H3K79/H4K20雙突變elp3△菌株。
　　 結論:1、組蛋白H3K79,H4K20突變?yōu)榱涟彼岵煌潭冉档土私湍负腿薊LP3對elp3△菌株生長缺陷和SSA3、GAL1表達延遲缺陷的補償功能。組蛋白雙突變情況下,轉入完整及第二結構域缺失的酵母和人ELP3各轉化株之間的生長差異不如對應的單突變株之間的差異明顯。但各組蛋白突變均未使elp3△菌株產(chǎn)生比組蛋白野生elp3△菌株更為嚴重的缺陷表型,表明Elp3可

8、能與H3K79,H4K20的甲基化狀態(tài)并無直接關系。
　　 2、組蛋白H3K79單突變elp3△菌株產(chǎn)生比組蛋白H4K20單突變elp3△菌株更為嚴重的生長缺陷,H4K20突變elp3△菌株生長不如H3K79/H4K20雙突變株。表明組蛋白不同位點的甲基化修飾對細胞生長影響不同,組蛋白H3K79和H4K20維持一定的甲基化水平對酵母細胞的正常生長尤其重要,在不利條件的快速適應方面H3K79的甲基化平衡可能比H4K20更為重要。<