蠟梅H3組蛋白基因CpH3的克隆及功能初步分析.pdf

1、真核生物細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)是一切遺傳學(xué)過程的物質(zhì)基礎(chǔ)，而組蛋白(histones)是存在于真核生物染色體內(nèi)的與DNA結(jié)合的一類小分子堿性蛋白質(zhì)，是染色體基本結(jié)構(gòu)單位核小體的重要組成成分。組蛋白八聚體是由核心組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成的異源二聚體。其中H3組蛋白是構(gòu)成核小體的一類富含賴氨酸的組蛋白，在進化上比較保守，在植物中主要分為H3.1型和H3.2型。H3.1型組蛋白為復(fù)制依賴性組蛋白，主要在細(xì)胞的分裂期大量表達;H3.2型組

2、蛋白為非復(fù)制依賴性組蛋白，通常該類蛋白是高度乙酰化的，可存在于植物的分生組織中，這兩種類型的主要區(qū)別是有無內(nèi)含子的存在。組蛋白主要通過乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化等共價化學(xué)修飾作用來調(diào)節(jié)基因的表達水平。
　　 蠟梅（Chimonanthuspraecox）是蠟梅科（Calycanthaceae）蠟梅屬（Chimonanthus）落葉叢生灌木，冬季開花并且具有較強的耐寒性、耐旱性。蠟梅中組蛋白H3是否參與其高效的逆境

3、防御機制為本研究的主要目的。本實驗從已構(gòu)建好的蠟梅花cDNA文庫中成功克隆得到一個組蛋白H3序列，命名為CpH3（Genebank登錄號為JQ952597）。通過對該基因在蠟梅不同組織和脅迫反應(yīng)中的轉(zhuǎn)錄水平變化分析，并且構(gòu)建植物超表達載體轉(zhuǎn)化煙草，分析該基因的功能。主要的研究結(jié)果有:
　　 1CpH3的分子特征
　　 通過隨機克隆測序的的方法，獲得蠟梅組蛋白H3的cDNA序列，該基因含有411bp的最大ORF，編碼136

4、個氨基酸殘基。BLAST分析表明該基因序列與其他植物組蛋白H3序列有很高的同源性，設(shè)計特異引物并以DNA為模板克隆獲得大小約為1200bp的條帶，與cDNA序列進行序列比對發(fā)現(xiàn)，該序列含有三段內(nèi)含子，并且都屬于GT-AG類型內(nèi)含子，推測本實驗獲得的組蛋白H3為H3.2型。進行信息學(xué)分析表明，該蛋白沒有信號肽，在細(xì)胞核內(nèi)大量存在;該蛋白主要以50％的α-螺旋以及47.8％的無規(guī)則卷曲組成;并且該蛋白存在3個絲氨酸磷酸化位點、5個蘇氨酸磷酸

5、化位點。
　　 2CpH3基因的轉(zhuǎn)錄水平分析
　　 實時熒光定量分析表明CpH3基因在蠟梅成熟葉片中的表達量最高，在莖、子葉和花中的表達量次之，在根和幼葉中的表達量最低。在3輪花器官中的表達分析表明在外瓣和中瓣中的表達量較高，內(nèi)瓣、雌蕊、雄蕊中表達量較低?；òl(fā)育時期的表達分析表明該基因在花發(fā)育過程中盛開期表達最高，其他時期表達量相對較低。經(jīng)過非生物脅迫處理后的定量分析表明，進行高鹽脅迫15分鐘CpH3基因表達水平迅速提高

6、，一小時后該基因表達水平下降，并且遠(yuǎn)低于對照水平，表明該基因?qū)τ谙灻菲鸬揭欢ǖ哪望}作用。然而該基因在受到高溫、低溫、干旱、ABA處理后，CpH3基因的表達水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照，說明該基因的表達響應(yīng)非生物脅迫發(fā)生變化，推測該基因可能參與了植物發(fā)育過程以及非生物脅迫的響應(yīng)。
　　 3CpH3基因在煙草中的超表達
　　 本實驗成功構(gòu)建了植物表達載體pCAMBIA2301g-CpH3，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法