酵母組蛋白H3K9L、K27L單突變及雙突變對Elp3功能和SSA3等表達的影響.pdf

1、目的:組蛋白乙?；?、甲基化等表觀遺傳修飾對基因表達調控具有重要影響。已有的研究結果表明，由6個亞基組成的酵母Elongator復合物作為一個具有組蛋白乙?；D移酶活性的復合體協(xié)助高度磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ參與SSA3，GAL1等基因的轉錄延伸過程。在體外去除HeLa細胞抽提物中的Elongator復合物可降低其轉錄染色質模板的速率，也提供了人Elongator復合物參與轉錄延伸的生化證據。已知人與酵母Elongator復合物組成高度保守

2、,功能也極為相似,其Elp3亞基C端的保守區(qū)是組蛋白乙?；D移酶活性的核心,在N端還存在第二結構域——即潛在的組蛋白去甲基化酶活性結構域。目前已有較多針對Elp3HAT活性功能的報道,但對Elp3第二結構域功能及其與組蛋白甲基化修飾之間的關系研究較少。
　　 為了解組蛋白甲基化狀態(tài)與人Elp3功能和特定基因表達的關系,本文構建特定位點組蛋白甲基化突變株,運用酵母功能互補實驗和基因表達分析體系研究基因組水平甲基化改變對全長和第二結

3、構域缺失的酵母和人ELP3補償功能的影響,為深入研究Elongator復合物的催化亞基Elp3和其第二催化結構域在真核基因表達調控中的功能奠定基礎,也為探索某些與轉錄相關疾病的發(fā)生機理，疾病預防、檢測、治療和預后提供有價值的信息。
　　 方法:首先運用定點突變技術獲得含有與突變有關的組蛋白特定甲基化位點(H3K9，H3K27)氨基酸突變的著絲粒型載體；然后通過PlasmidShuffle實驗用突變組蛋白取代野生組蛋白得到的組蛋白

4、H3/H4特定甲基化位點突變并伴隨酵母ELP3基因缺失的系列突變菌株；運用乙酸鋰轉化法將Elp3系列質粒轉入系列組蛋白突變并伴隨ELP3缺失的突變株:最后通過高溫、高鹽、咖啡因等敏感性實驗和SSSA3、GAL1等基因表達的檢測，確定基因組水平甲基化位點突變對人ELP3補償功能和SSA3、GAL1等基因表達的影響。
　　 結果:1、運用定點突變技術獲得含有與突變有關的組蛋白特定甲基化位點(H3K9，H3K27)氨基酸突變的著絲粒型

5、載體。
　　 2、利用PlasmidShuffle技術構建了含組蛋白H3/H4的K9、K27單突變?yōu)楹碗p突變?yōu)榱涟彼岬膃lp3Δ菌株。
　　 3、將全長和第二結構域缺失的酵母和人ELP3轉入上述組蛋白突變elp3Δ菌株進行的功能互補和基因表達分析,結果表明上述組蛋白甲基化位點突變嚴重影響了hELP3對elp3Δ菌株生長缺陷和SSA3和GALl延遲表達的補償功能，并使yELP3的補償功能明顯降低。
　　 4、在供試

6、的各種條件下，轉入yELP3基因的H3K9/H3K27雙突變elp3Δ菌株生長不如H3K9或H3K27單突變elp3Δ菌株,而H3K27單突變elp3Δ菌株生長不如H3K9單突變elp3Δ菌株。
　　 結論:1、組蛋白H3K9，H3K27突變?yōu)榱涟彼岵煌潭冉档土私湍负腿薊lp3對elp3Δ菌株生長缺陷和SSA3、GAL1表達延遲缺陷的補償功能。在組蛋白雙突變條件下，轉入完整及第二結構域缺失的酵母和人Elp3各轉化株之間的生長差

7、異不如對應的單突變株之間的差異明顯。但各組蛋白突變均未使elp3Δ菌株產生比組蛋白野生elp3Δ菌株更為嚴重的缺陷表型，提示Elp3可能與H3K9，H3K27的甲基化狀態(tài)并無直接關系。
　　 2、組蛋白H3K9/H3K27雙突變elp3Δ菌株產生比組蛋白H3K9或H3K27單突變elp3Δ菌株更為嚴重的生長缺陷，H3K27突變elp3Δ菌株生長不如H3K9突變株。表明組蛋白H3K9和K27維持一定的甲基化水平在對酵母細胞的正常生