草莓鑲脈病毒P6基因致病機制研究.pdf

1、病毒能夠編碼一些與致病相關的蛋白從而調控寄主植物生理代謝過程，讓寄主產(chǎn)生相關癥狀。研究證明，草莓鑲脈病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）編碼的P6蛋白是一個癥狀決定子，在病毒侵染草莓的過程中起關鍵作用，但目前尚不明確其具體分子致病機制。本課題開展了P6蛋白的相關致病功能研究，并且利用轉錄組測序技術（RNA-Seq）全面了解病毒侵染草莓后各基因的表達差異，進一步驗證差異基因的功能，為在分子水平上闡述

2、 SVBV的致病機制奠定了基礎。
　　1.瞬時浸潤SVBV P6及其突變體
　　含pGR-P6，pGR-?P6和空載體pGR106的農桿菌分別浸潤本氏煙，pGR-P6和pGR-?P6浸潤的表型相似，新葉均有嚴重癥狀，而pGR106浸潤，只有較輕的癥狀。ELISA檢測P6和?P6是否在本氏煙中表達，結果表明，pGR-P6能表達P6蛋白，而pGR-?P6不能表達P6蛋白。為了進一步確定?P6蛋白的表達情況，構建重組表達載體pGR

3、-P6-GFP和pGR-?P6-GFP，瞬時浸潤本氏煙，結果發(fā)現(xiàn)， pGR-P6-GFP浸潤的本氏煙葉片出現(xiàn)綠色熒光，而 pGR-?P6-GFP浸潤的本氏煙葉片無綠色熒光出現(xiàn)，說明P6能夠正常翻譯下游GFP，而?P6不能正常翻譯。結果表明，SVBV P6可能在RNA水平上影響植株的癥狀表型。
　　2. SVBV P6對PVX的復制及對GFP表達的影響
　　pGR-P6、pGR-?P6和空載體 pGR106分別浸潤本氏煙葉片，

4、Northern blot和 qRT-PCR檢測系統(tǒng)葉中 PVX RNA的積累水平。結果發(fā)現(xiàn)，接種 pGR-P6、pGR-?P6和pGR106的本氏煙系統(tǒng)葉中，PVX RNA的積累水平差異不顯著，說明P6和?P6對PVX的復制水平均沒有影響。pBIN-P19、pCAM-P6、pCAM-?P6和空載體 pCAM2300分別與 pCAM-GFP共浸潤本氏煙葉片，Northern blot和Westhern blot分別檢測 GFP在 RNA

5、水平和蛋白水平上的表達量。結果發(fā)現(xiàn)， pCAM-P6和 pCAM-GFP共浸潤， GFP的表達量顯著提高；pCAM-?P6和pCAM-GFP共浸潤，GFP表達量與陰性對照相比差異不顯著，說明P6蛋白能夠促進GFP的表達。
　　3. SVBV P6和突變體的細胞定位
　　pCAM-P6-GFP瞬時浸潤本氏煙葉片，融合蛋白P6-GFP的熒光主要分布在細胞核上。說明P6蛋白可以在細胞核中富集。生物信息學分析表明，P6蛋白的192-

6、223aa和402-426aa可能是核定位功能域。構建重組表達載體pCAM-P6(?192-223aa)-GFP和 pCAM-P6(?402-426aa)-GFP，分別瞬時浸潤本氏煙葉片。結果發(fā)現(xiàn)，P6和P6(?192-223aa)均定位于細胞核中，而P6(?402-426aa)主要分布于細胞輪廓上，說明P6蛋白402-426 aa可能是P6的核定位信號區(qū)域。這一部分可能是P6的致病功能域。
　　4. SVBV P6蛋白與SVBV

7、編碼其他蛋白間的互作
　　雙分子熒光互補驗證SVBV P6蛋白與SVBV編碼其他蛋白間互作。YFPn-P6分別與YFPc-P2和YFPc-P4共浸潤，YFPc-P6分別與YFPn-P2， YFPn-P4共浸潤。結果發(fā)現(xiàn)，各處理組均無黃色熒光，說明P6與P2和 P4均不能互作。進一步驗證P6和 P4蛋白的自身互作，YFPn-P6與YFPc-P6及YFPn-P4與YFPc-P4共浸潤，結果發(fā)現(xiàn)，P4本身可以互作，有顯著的熒光出現(xiàn)，P6

8、自身不能互作，無熒光。
　　酵母雙雜交驗證SVBV P6蛋白與P4蛋白的互作。處理組AD-P6與BK-P4、BK-P6與AD-P4、AD-P6與BK-P6及AD-P4與BK-P4分別共轉化酵母，結果發(fā)現(xiàn)，僅AD-P4與BK-P4共轉化酵母可以長出白色酵母菌落，說明P6與P4不能互作，P6自身不能互作，而P4自身互作。
　　5.感染SVBV的森林草莓和健康森林草莓轉錄組的差異表達
　　利用新一代測序技術（RNA-Seq）

9、，構建了感染 SVBV的森林草莓以及健康森林草莓的文庫，比較了感病森林草莓與健康森林草莓基因表達的差異。轉錄組測序共得到36850個不同的Unigene，其中517個基因為差異表達基因。通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)，涉及牛磺酸代謝、植物病原互作等途徑在 SVBV侵染森林草莓中起重要作用。研究結果首次闡述了 SVBV與寄主草莓之間的基因互作關系，為研究SVBV侵染森林草莓的致病機理奠定了基礎。
　　6. P6與草莓宿主基因MYB12的互作