地衣芽孢桿菌α-淀粉酶定向進(jìn)化研究.pdf

1、目的：本文主要對地衣芽孢桿菌CICC10181耐高溫α-淀粉酶基因進(jìn)行克隆、表達(dá)、及定向進(jìn)化的研究。 方法：查閱Genbank上已提交的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因編碼序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出α-淀粉酶基因產(chǎn)物，大小為3000bp；利用PCR技術(shù)截取上游760bp進(jìn)行產(chǎn)物測序，結(jié)果表明與其它芽孢桿菌屬來源的α-淀粉酶基因具有很高的同源性，同源性達(dá)到99％；利用巢式PCR擴(kuò)增出1580bp大小的α-淀粉酶基因產(chǎn)物，回收目的片段，克隆至大

2、腸桿菌；經(jīng)過蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，破壁進(jìn)行酶活測定；用SDS-PAGE測定淀粉酶融合蛋白分子量；利用易錯(cuò)PCR技術(shù)將1580bp片段分為760bp和820bp兩個(gè)片段進(jìn)行分子突變，用重疊延伸技術(shù)連接成完整的α-淀粉酶突變基因；克隆至大腸桿菌，用PCR鑒定及錐蟲藍(lán)培養(yǎng)基篩選陽性克??；通過蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行酶活性及蛋白質(zhì)分子量測定；測序確定突變位點(diǎn)。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)從地衣芽孢桿菌CICC10181中擴(kuò)增出α-淀粉酶基因，分子量大

3、小為3000bp； 擴(kuò)增上游760bp進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序，結(jié)果表明與其它芽孢桿菌屬來源的α-淀粉酶基因具有很高的同源性，同源性達(dá)到99％； 利用巢式PCR技術(shù)成功的擴(kuò)增出α-淀粉酶基因，大小為1580bp； 連接至pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并篩選出6個(gè)陽性克隆； 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、表達(dá)淀粉酶融合蛋白，SDS-PAGE電泳顯示分子量大小為60KD；經(jīng)超聲波破壁后測定胞內(nèi)淀粉酶活性，結(jié)果顯示：活力

4、達(dá)到101U； 取40號陽性克隆質(zhì)粒作為模板，利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對目的基因進(jìn)行760bp和820bp兩片段分子突變，最后重疊延伸得到大小為1580bp的淀粉酶突變基因； 連接至pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用錐蟲藍(lán)培養(yǎng)基及PCR鑒定，篩選出2個(gè)陽性克??； 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)得到α-淀粉酶融合蛋白，分子量大小為60KD，測得胞內(nèi)淀粉酶活性達(dá)到了156U； 測序鑒定突變點(diǎn)三處：C163G，T417A，A5