Vps33b調(diào)控血小板α-顆粒形成的機(jī)制研究.pdf

1、ARC綜合癥（arthrogryposis-renal dysfunction-cholestasis,ARC）是一種常染色體隱性遺傳性疾病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)攣縮、腎功能衰竭、膽汁淤滯以及血小板α-顆粒內(nèi)容物的缺失，研究表明Vps33b基因突變是導(dǎo)致這個(gè)疾病發(fā)生的分子機(jī)制之一，因此我們推測(cè)Vps33b蛋白可能參與了α-顆粒的形成。
　　在本研究中，我們選用HEK293T和Meg01細(xì)胞系作為體外研究工具，利用蛋白質(zhì)譜和免疫共沉淀的方法，

2、確定了VIPAR、Sec22b和α-tubulin與Vps33b蛋白存在相互作用，并通過(guò)構(gòu)建表達(dá)Vps33b不同截短體蛋白結(jié)合免疫沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Vps16b與全長(zhǎng)的Vps33b蛋白結(jié)合，而α-tubulin和Sec22b則分別與Vps33b中的兩個(gè)Sec-1片段結(jié)合。熒光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，在分化的Meg01細(xì)胞生成前血小板的向外延伸的神經(jīng)突觸樣細(xì)絲中，Vps33b復(fù)合物呈現(xiàn)出細(xì)絲狀的分布，并且vWF陽(yáng)性囊泡與Vps33b復(fù)合物存在明

3、顯的共定位現(xiàn)象，提示Vps33b參與了血小板α-顆粒的運(yùn)輸。
　　為了在體觀察Vps33b蛋白敲除對(duì)血小板功能的影響，我們分別構(gòu)建了全身性Vps33b基因敲除小鼠、巨核系/血小板特異性Vps33b基因敲除小鼠以及他莫昔芬誘導(dǎo)的造血干細(xì)胞Vps33b基因敲除三種小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vps33b基因純合缺失的小鼠存在胚胎早期致死性，造成純合子小鼠不能獲得，對(duì)雜合子小鼠的血小板功能進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)未受到明顯影響；在對(duì)巨核系/血小板特異性Vps

4、33b基因敲除小鼠的血小板進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)Vps33b蛋白僅有部分被敲除，血小板α-顆粒的形成以及血小板相關(guān)功能仍未受到影響；但當(dāng)我們對(duì)造血干細(xì)胞Vps33b基因敲除的小鼠血小板進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)Vps33b蛋白被完全敲除，并表現(xiàn)為血小板α-顆粒的缺失和相關(guān)聚集功能受到影響，從而闡明Vps33b蛋白確實(shí)參與了α-顆粒的形成，且有少量的Vps33b蛋白存在即可，并且發(fā)現(xiàn)了Vps33b蛋白的產(chǎn)生階段早于巨核細(xì)胞的發(fā)生。
　　為了進(jìn)一步證實(shí)

5、Vps33b復(fù)合物參與血小板α-顆粒的形成，我們通過(guò)分離胎肝誘導(dǎo)分化原代巨核細(xì)胞，分別觀察Vps33bfl/fl-Scl-Cre-和Vps33bfl/fl-Scl-Cre+小鼠巨核細(xì)胞不同分化階段的vWF陽(yáng)性囊泡（作為α-顆粒的指示標(biāo)記）和α-tubulin的定位情況，發(fā)現(xiàn)Vps33b蛋白敲除的巨核細(xì)胞在分化階段存在vWF陽(yáng)性囊泡向遠(yuǎn)端運(yùn)輸障礙，vWF陽(yáng)性囊泡均滯留在巨核細(xì)胞胞漿內(nèi)，從而揭示Vps33b蛋白可能是通過(guò)與α-tubulin