TRAF3和VPS33B在血小板激活和血栓形成中的作用及其機(jī)制.pdf

1、第一部分TRAF3和VPS33B血小板特異性基因敲除小鼠的繁殖和鑒定
　　目的：制備腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3（TNF receptor associated factor3, TRAF3）和空泡分選蛋白33同系物B（vacuolar protein sorting33 homolog B，VPS33B）血小板特異性基因敲除小鼠，用于研究TRAF3和VPS33B在血小板功能中的作用。
　　方法：通過實(shí)驗(yàn)室已有的VPS33Bf

2、l/fl基因打靶小鼠,TRAF3fl/fl基因打靶小鼠和Pf4 Cre小鼠，繁殖建立血小板的VPS33B和TRAF3特異性基因敲除小鼠和它的背景對照雜合子小鼠。并用PCR和western blotting方法檢測基因敲除小鼠的基因型和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：通過數(shù)代的繁殖，建立起穩(wěn)定可靠的TRAF3和VPS33B基因敲除模型，并在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，采取小鼠尾部 PCR基因鑒定的方法，來檢測基因敲除小鼠和其雜合子基因?qū)φ?，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

3、
　　結(jié)論：LoxP/Cre條件性基因敲除的方法，能克服基因敲除TRAF3和VPS33B引起的高的致死率，成功建立了研究TRAF3和VPS33B的條件性基因敲除小鼠模型。
　　第二部分TRAF3基因敲除對血小板聚集和血栓形成的影響及其機(jī)制
　　目的：CD40配體(CD40L)是腫瘤壞死因子 TNF家族的成員分子。CD40L結(jié)合到CD40上，增強(qiáng)血小板激活和血栓形成。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TNF receptor a

4、ssociated factor, TRAF）家族在CD40L-CD40相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演重要角色。目前，尚無報道研究 TRAF家族成員 TRAF3在血小板中的表達(dá)和功能。因此，本研究通過 TRAF3特異性基因敲除小鼠研究 TRAF3在血小板聚集和血栓形成中的作用及其機(jī)制。
　　方法：采用血小板聚集儀觀察 TRAF3-/-和 wildtype小鼠對不同激動劑（collagen，thrombin，Par4）誘導(dǎo)的血小板聚集的影響，并

5、檢測外源性添加CD40L對 TRAF3-/-和 wildtype小鼠血小板聚集的影響。采用流式細(xì)胞術(shù)和 western blotting檢測TRAF3-/-和wildtype小鼠血小板上GPⅥ和整合素β3表達(dá)的變化，以及TRAF3-/-和wildtype小鼠止血和血栓形成時間的變化。
　　結(jié)果：本研究發(fā)現(xiàn)，在人和小鼠的血小板細(xì)胞中都可檢測到TRAF3的表達(dá)。作為血小板聚集和激活的負(fù)性調(diào)控因子，TRAF3敲除顯著增加凝血酶和膠原誘導(dǎo)

6、的血小板聚集和釋放。血小板表面膠原受體GPⅥ、整合素αⅡbβ3和TRAF2的表達(dá)都沒有被敲除 TRAF3影響，說明在 TRAF3敲除小鼠中增高的血小板激活并不是因?yàn)檠“迨荏w表達(dá)的增高，也不是由于 TRAF3基因敲除引起其它TRAF家族蛋白比如TRAF2蛋白表達(dá)的變化。在TRAF3敲除小鼠中，氯化鐵誘導(dǎo)的動脈血栓模型中的血栓形成時間顯著降低，但在小鼠斷尾流血時間實(shí)驗(yàn)中，止血時間未發(fā)現(xiàn)受TRAF3基因敲除的影響。
　　結(jié)論：TRAF

7、3在血小板激活和血栓形成中具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。這一作用和TRAF家族其它的血小板功能蛋白不同，不依賴CD40L和CD40等血小板表面的受體實(shí)現(xiàn)。
　　第三部分 VPS33B基因敲除對血小板聚集和血栓形成的影響及其機(jī)制
　　目的：整合素是一種異質(zhì)二聚體膜蛋白，包含α和β亞基，在細(xì)胞粘附和轉(zhuǎn)移等各種生理功能中起著基礎(chǔ)性的重要作用，血小板整合素αIIbβ3在血小板功能和生理止血中可能有著重要的意義。調(diào)節(jié)血小板中整合素激活的分子機(jī)制目

8、前尚不清楚。VPS33B是一種新的整合素結(jié)合蛋白。目前，尚無報道研究VPS33B在血小板中的表達(dá)和功能。因此，本研究通過VPS33B特異性基因敲除小鼠研究VPS33B在血小板聚集和血栓形成中的作用及其機(jī)制。
　　方法：采用血小板聚集儀觀察 VPS33B敲除小鼠對不同激動劑（collagen，thrombin）誘導(dǎo)的血小板聚集和釋放的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測VPS33B敲除小鼠和野生對照型小鼠血小板血小板整合素αIIbβ3等指標(biāo)的含

9、量以及結(jié)合率。采用熒光顯微鏡觀察VPS33B敲除和過量表達(dá)VPS33B對血小板在固化纖維蛋白原上的擴(kuò)展等功能影響。觀察VPS33B敲除對斑塊回縮的影響。采用蛋白印跡法檢測 VPS33B對血小板的主要信號通路蛋白及血小板“由外向內(nèi)”信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。
　　結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn) VPS33B作為 Sec1/Munc18（SM）蛋白家族的一員，能直接和整合素β亞基結(jié)合。在 CHO細(xì)胞株中過量表達(dá) VPS33B能增強(qiáng)αIIbβ3 outside-

10、in信號通路而不影響 inside-out信號通路。我們構(gòu)建了血小板特異性VPS33B敲除小鼠，從這些小鼠血液中分離的血小板具備正常的生理形態(tài)，然而它們在纖維蛋白原上的擴(kuò)展功能發(fā)生了改變，斑塊回縮功能也受到了影響。在VPS33B敲除小鼠中，在低濃度激動劑的刺激下，血小板的聚集和ATP的釋放功能都減弱。在VPS33B敲除小鼠中小鼠斷尾流血時間和血栓形成時間對比野生型小鼠都延長了。
　　結(jié)論：我們的研究表明 VPS33B是一種新的血小