PARP和血小板IKKβ在動脈粥樣硬化形成中的作用機制研究.pdf

1、論文一
　　 PARP在動脈粥樣硬化形成中的作用及機制研究
　　 背景：
　　 動脈粥樣硬化是很多心血管疾病，腦血管疾病和外周血管疾病的主要發(fā)病原因。動脈粥樣硬化除了引起血管狹窄外，還能導致斑塊破裂，血栓形成，從而堵塞血管，造成嚴重的不良心腦血管事件，包括心肌梗死、腦梗死、猝死等。動脈粥樣硬化形成的原因非常復雜。血脂異常、內皮功能障礙、炎癥細胞浸潤、氧化應激、細胞凋亡、脂質沉積、血管生成、膠原代謝等因素均在動脈粥

2、樣硬化中發(fā)揮了一定的作用。在動脈粥樣硬化的早期階段，內皮功能障礙發(fā)揮了主要的作用。所以，維持內皮的正常功能對于預防動脈粥樣硬化意義重大。
　　 多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1）是PARP家族最主要的亞型，發(fā)揮了PARP活性的90％。PARP-1能夠以NAD+為底物通過催化ADP核糖單位結合到目的蛋白或者PARP本身進行修飾。PARP-1在氧化應激、亞硝酸鹽等損

3、傷DNA時，能夠識別DNA損傷，被激活。DNA損傷嚴重時，PARP過度激活，能夠引起細胞能量耗竭甚至死亡。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，PARP-1激活廣泛參與了動脈粥樣硬化、心肌梗死、心力衰竭等各種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。
　　 抑制PARP的激活，能夠有效延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生，增加動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。目前研究認為抑制PARP激活主要通過以下機制減緩了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展:一是抑制炎癥因子的表達和巨噬細胞的浸潤，PARP-1能

4、夠與核轉錄因子kappaB（nuclearfactorkappaB，NFκB）結合，促進NFκB的激活，抑制PARP-1能夠有效減少血管細胞粘附分子-1(vascularcelladhesionmolecule-1，VCAM-1)、單核細胞趨化蛋白-1(monocytechemotacticprotein-1，MCP-1)、E-選擇素(E-selectin)、P-選擇素(P-selectin)等炎癥因子的表達，并且通過抑制炎癥因子的表達

5、，降低單核細胞的趨化性，減少了斑塊內巨噬細胞的含量;二是通過增加金屬蛋白酶組織抑制劑-3(tissueinhibitorofmetalloproteinase-3，TIMP-3)的表達，減少了膠原的代謝;三是通過減少內皮細胞和巨噬細胞凋亡，維持了內皮的完整性，減輕了壞死核心的形成;四是減少活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)和活性氮(reactivenitrogenspecies，RNS)的產生，減少了氧化應激和

6、硝基化產物的產生;五是維持了內皮的正常功能。
　　 一氧化氮(nitricoxide，NO)在內皮功能中起了關鍵性的作用，它能夠調節(jié)血管的張力和局部血流，抑制平滑肌細胞的增殖，調控白細胞和內皮之間的相互作用，并在血栓形成中發(fā)揮了一定的作用。作為重要的血管保護分子，NO能夠有效抑制動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展。NO在血管系統(tǒng)主要由內皮型NO合酶(endothelialnitricoxidesynthase，eNOS)和誘導型NO合酶(

7、induciblenitricoxidesynthase，iNOS)產生。盡管已有研究探討了PARP對eNOS、iNOS的作用，但PARP和NO生成的關系仍未明確。
　　 脂質過氧化在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要的作用。脂質過氧化過程中，產生的毒性醛類代謝產物，可以與核酸/蛋白結合形成各種加合物，進而導致DNA損傷/缺失/突變以及蛋白質失活，造成DNA和蛋白質的功能異常，甚至可以直接損傷細胞和組織，另外某些毒性醛類可以

8、誘發(fā)和加重氧化應激，這些都促進了動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。醛脫氫酶類能夠將毒性醛類代謝成低毒性的羧化物，從而減少脂質過氧化引起的細胞和組織的損傷。在各種醛脫氫酶類中，乙醛脫氫酶2(aldehydedehydrogenase2，ALDH2)在代謝毒性醛類物質過程中發(fā)揮了主要的作用。PARP能否通過調控ALDH2的活性影響動脈粥樣硬化的發(fā)展，目前尚缺乏這方面的研究。
　　 研究目標：
　　 1.通過PARP抑制劑和敲基因小鼠

9、的方法，進一步明確PARP-1對動脈粥樣硬化的影響;
　　 2.抑制PARP激活后，觀察主動脈NO表達的變化;
　　 3.尋找PARP調控NO表達的分子機制。
　　 4.探討PARP對ALDH2表達和活性的作用及可能的機制
　　 研究方法：
　　 1.敲基因小鼠的產生
　　 PARP-1-/-小鼠購買自美國Jackson實驗室，為用于動脈粥樣硬化的研究，將該小鼠與C57BL/6J小鼠雜交至

10、少7代。然后，將得到的C57BL/6J基因基礎的PARP-1-/-小鼠與apoE-/-雜交獲得實驗用的apoE-/-和apoE-/-PARP-1-/-小鼠。
　　 2.動脈粥樣硬化模型
　　 選擇6-8周apoE-/-小鼠或者apoE-/-PARP-1-/-小鼠分為apoE-/-小鼠+正常飲食組（control組）、apoE-/-小鼠+高膽固醇組(HD組)、apoE-/-小鼠+高膽固醇+DPQ組（HD+DPQ組）和apo

11、E-/-PARP-1-/-小鼠+高膽固醇飲食組高膽固醇飲食(HD+DKO組)，12周后發(fā)生自發(fā)性動脈粥樣硬化。
　　 3.組織學染色
　　 高膽固醇飲食12周后，麻醉小鼠，采血后，取小鼠心臟和主動脈，將胸腹主動脈剝去外膜后，進行油紅O染色;對主動脈根部進行冰凍切片后，行油紅O染色。用ImagePro-Plus軟件對胸腹主動脈和主動脈根部斑塊面積進行測量。
　　 4.免疫組化染色
　　 對主動脈根部動脈粥樣

12、硬化斑塊切片后，進行PARP激活產物多聚腺苷二磷酸核糖（polyADPribose，PAR），DNA氧化損傷產物8-羥基-鳥嘌呤脫氧核苷酸(8-oxo-dG)和3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)的組織化學染色。
　　 5.NO含量的測量
　　 總一氧化氮含量采用經典Griessreagent檢測亞硝酸鹽，從而測定出總一氧化氮。
　　 6.蛋白質印跡
　　 目的蛋白的表達，采用wes

13、ternblotting的方法進行檢測，利用β-actin作為內參對目的蛋白進行定量。
　　 7.精氨酸酶活性檢測
　　 裂解液裂解主動脈或者細胞，提取蛋白，加入左旋精氨酸(L-arginine)后，孵育37℃，60分鐘。酶活性表示為納摩爾尿素每毫克蛋白每分鐘(nmolurea/mgprotein/min)。
　　 8.小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養(yǎng)
　　 取6到8周的小鼠，腹腔注射2ml的4％的巰基乙酸(t

14、hioglycollate)，3天后，打開腹腔，將巨噬細胞分離出來后，鋪六孔板，用于后續(xù)實驗。
　　 9.小鼠內皮細胞的分離培養(yǎng)
　　 麻醉小鼠后，打開胸腔，采用心臟灌注的方法，將血液排出，取胸主動脈，剝除外膜及結締脂肪組織，剖開，鋪在膠原包被的六孔板上，待內皮細胞爬出后，消化培養(yǎng)內皮細胞。
　　 10.人動脈內皮細胞(humanaorticendothelialcells，HAECs)的培養(yǎng)及實驗
　　

15、 在37℃，5％CO2孵箱中，用ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)主動脈內皮細胞，根據(jù)實驗需要進行傳代鋪板。
　　 結果：
　　 1.PARP抑制劑或者PARP-1基因敲除有效延緩了動脈粥樣硬化的形成:通過大體油紅O染色或者分析主動脈根部斑塊的面積發(fā)現(xiàn)，與普通高膽固醇飲食的小鼠對比，抑制PARP激活能夠有效減少動脈粥樣硬化的生成。
　　 2.PARP抑制劑或者PARP-1基因敲除對血象、血脂水平無明顯影響。
　　 3.PA

16、RP抑制劑或者PARP-1基因敲除減少了主動脈斑塊內的氧化應激和硝酸化產物的生成:通過免疫組化分析斑塊內氧化應激產物8-oxo-dG和硝基化產物3-硝基酪氨酸的表達發(fā)現(xiàn)，抑制PARP激活能夠有效減輕動脈粥樣硬化斑塊內氧化應激和硝基化產物的產生。
　　 4.PARP抑制劑或者PARP-1基因敲除增加了主動脈NO的含量:PARP抑制劑或者PARP-1基因敲除增加了主動脈內NO的生成。通過分析與NO生成相關的蛋白發(fā)現(xiàn)，抑制PARP激活

17、減少了精氨酸酶Ⅱ的表達及精氨酸酶的活性，同時發(fā)現(xiàn)抑制PARP激活雖然減少了iNOS的表達但是增加了eNOS的磷酸化水平。
　　 5.PARP-1基因敲除只影響了精氨酸酶Ⅱ的表達，對精氨酸酶Ⅰ沒有明顯的影響:在氧化低密度脂蛋白刺激下，發(fā)現(xiàn)PARP-1基因敲出能阻止小鼠腹腔巨噬細胞內精氨酸酶Ⅱ的增加，但精氨酸酶Ⅰ的表達沒有明顯改變。
　　 6.PARP-1基因敲除增加了小鼠內皮細胞NO的生成。
　　 7.抑制PARP

18、激活增強了HAECs中ALDH2的活性:Ox-LDL刺激HAECs，能夠抑制ALDH2的活性，并呈時間和濃度依賴性，但沒有改變ALDH2的蛋白表達。PARP抑制劑能夠部分阻止ox-LDL引起的ALDH2活性的抑制。
　　 結論：
　　 PARP抑制劑或PARP-1基因敲除有效延緩了動脈粥樣硬化的形成。抑制PARP活性能夠減少ArgⅡ的表達，增加eNOS的磷酸化水平，從而增加了NO的表達，維持了內皮的正常功能;另外，抑制P

19、ARP活性能夠阻止ox-LDL引起的ALDH2活性下降。
　　 論文二
　　 血小板IKKβ在動脈粥樣硬化形成及新生內膜增生中的作用機制研究
　　 背景：
　　 白細胞在血管內皮上的滾動、粘附和侵潤是動脈粥樣硬化形成的關鍵因素。動脈粥樣硬化最初是由內皮功能障礙或內皮損傷開始的，內皮在TNFα、LPS、血脂異?；驒C械性損傷刺激后，表達P選擇素糖蛋白配體1(PSGL-1)、VCAM-1等炎癥粘附分子或暴露內皮

20、膠原，引起血液中白細胞、血小板等在內皮表面上滾動和粘附，白細胞粘附在血管內皮后，在PECAM-1、ICAM-1等分子作用下，侵潤至內皮下，并在各種炎癥因子作用下逐漸變?yōu)榫奘杉毎?，吞噬脂質、死細胞等，形成血管局部的病灶，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。
　　 血小板是來源于骨髓巨核細胞的細胞碎片，有完整的細胞膜，但沒有細胞核。血小板的主要功能是介導凝血、止血和修復損傷血管。近幾年發(fā)現(xiàn)血小板除了上述功能外，還在動脈粥樣硬化、炎癥、免疫

21、和腫瘤轉移等疾病中發(fā)揮非常重要的作用。血小板可以在激活物如ADP、凝血酶、血栓烷A2、膠原等作用下發(fā)生激活、釋放、聚集和粘附等改變。血小板能夠參與白細胞在血管內皮表面上的滾動和粘附進而影響動脈粥樣硬化的發(fā)展。血小板介導白細胞的滾動和粘附，主要有兩個方面的機制:一是血小板首先通過血小板膜上的GPIbα、GPVI、α2β1、α(II)bβ3、JAM-A、JAM-C和CX3CR1等分子與內皮細胞表面的vWF因子或者內皮下膠原的結合，粘附在血管

22、的內皮的表面，然后血小板再通過膜表面上的P-選擇素與白細胞表面的PSGL-1相互作用，激活白細胞上Mac-1分子，最后血小板膜上的GPIbα分子與白細胞表面上的Mac-1分子結合，使白細胞緊密的粘附在血管內皮表面上;二是“蹭灰”機制，激活的血小板能夠與白細胞相互作用，將血小板表面上的P-選擇素、CCL5等分子通過血小板膜與白細胞膜融合的方式轉移到白細胞上，進而增強白細胞的粘附功能。
　　 核轉錄因子kappaB(nuclearf

23、actorkappaB，NF-κB)是炎癥、免疫、凋亡和細胞增值等的關鍵調控分子，參與了包括炎癥因子在內的超過150種基因的表達。正常情況下，NF-κB與它的抑制蛋白IκBα結合在一起，并不能發(fā)揮轉錄活性，當IκBα在IκB激酶(IκBkinase，IKK)作用下發(fā)生磷酸化降解后，NF-κB被釋放并發(fā)生核轉位與細胞核內相關基因的轉錄位點結合，NF-κB才能發(fā)揮其轉錄因子的作用。IKK有多個亞型，包括α、β、γ和新發(fā)現(xiàn)的ε四個亞型。其中，

24、IKKβ在磷酸化IκBα過程中發(fā)揮著主要作用。利用IKKβ的條件性敲基因小鼠，發(fā)現(xiàn)不同細胞中的NF-κB激活情況在動脈粥樣硬化中發(fā)揮了不同的作用。內皮細胞的IKKβ敲除后能夠減輕動脈粥樣硬化的發(fā)生，而單核細胞里面的IKKβ敲除后卻促進了動脈粥樣硬化的發(fā)展。
　　 近幾年發(fā)現(xiàn)，除了有核細胞具有NF-κB系統(tǒng)外，血小板也含有功能性的NF-κB系統(tǒng)。以往的研究表明，激活的血小板能夠促進動脈粥樣硬化的發(fā)展和損傷血管的內膜增厚。但是血小板

25、中的NF-κB被抑制后對動脈粥樣硬化有什么影響還缺乏相關方面的研究。因此，本課題主要圍繞著血小板中的NF-κB在血小板激活、釋放和聚集中的作用以及通過條件性基因敲除的方法抑制血小板中的NF-κB后對動脈粥樣硬化和血管內膜增厚的影響進行。
　　 研究目標：
　　 1.運用loxp-Cre系統(tǒng)，構建血小板特異性IKKβ敲基因小鼠;
　　 2.西方飲食飼養(yǎng)小鼠12周，觀察血小板IKKβ基因敲除后對自發(fā)性動脈粥樣硬化的影

26、響;
　　 3.通過導絲損傷頸動脈內皮，觀察血小板IKKβ基因敲除后對新生內膜增厚的影響;
　　 4.探討IKKβ基因敲除后對血小板功能的影響及機制。
　　 研究方法：
　　 1.血小板IKKβ特異性基因敲除小鼠的產生
　　 運用loxp-Cre系統(tǒng)構建血小板IKKβ特異性基因敲除小鼠。對PF4-Cre小鼠和floxed的IKKβ小鼠進行雜交產生IKKβfl/fl/PF4cre小鼠，IKKβfl/

27、fl/PF4cre小鼠即為血小板IKKβ基因敲除的小鼠。
　　 2.建立動脈粥樣硬化模型
　　 IKKβfl/fl/PF4cre小鼠與Ldlr-/-小鼠雜交產生Ldlr-/-IKKβfl/fl/PF4cre及對照Ldlr-/-IKKβfl/fl小鼠，給予西方飲食12周，對比自發(fā)性動脈粥樣硬化的大小。
　　 3.新生內膜增厚動物模型的建立
　　 首先，西方飲食飼養(yǎng)Ldlr-/-IKKβfl/fl/PF4cr

28、e及對照Ldlr-/-IKKβfl/fl小鼠2周，在解剖鏡下，從頸外動脈切口，利用導絲損傷小鼠的左頸總動脈5次，結扎頸外動脈，繼續(xù)喂養(yǎng)小鼠西方飲食4周，對頸總動脈的內膜增厚進行測量。
　　 4.血脂及血象分析
　　 血漿甘油三酯含量，低密度脂蛋白，高密度脂蛋白和總膽固醇用自動酶標生化儀檢測，血液中的白細胞、血小板等血細胞含量用Hemavet儀器檢測。
　　 5.骨髓移植
　　 Ldlr-/-小鼠在致死劑量

29、的射線照射后，采用尾靜脈注射法注射其他小鼠來源的骨髓細胞，包括IKKβfl/fl/PF4cre及對照Ldlr-/-IKKβfl/fl小鼠。讓骨髓移植的小鼠恢復4周后，進行頸動脈損傷引起的內膜增厚實驗。
　　 6.中性粒細胞耗竭對新生內膜增厚影響實驗
　　 為了探討中心粒細胞在內膜增厚中的作用，通過腹腔注射抗PMN抗體，耗竭血液循環(huán)中的中性粒細胞，進而判斷中心粒細胞在血小板IKKβ在影響新生內膜增厚中的作用。
　　

30、 7.Movat染色
　　 利用Movat染色技術對血管內膜和外膜的厚度進行測量。
　　 8.免疫組化染色
　　 選擇抗F4/80抗體，對頸動脈斑塊內的巨噬細胞的含量進行統(tǒng)計學分析。
　　 9.白細胞在損傷血管內皮表面的粘附實驗
　　 損傷頸動脈后，對在損傷血管表面上滾動和粘附的白細胞數(shù)在活體熒光顯微鏡下進行觀察計算。
　　 10.白細胞在激活的血小板上的粘附實驗
　　 從小鼠心臟

31、小心抽取血液，用檸檬酸鈉抗凝，分離獲得血小板并稀釋為2×109/ml，鋪于方形的玻璃毛細管中，待血小板粘附于毛細管后，用凝血酶刺激激活血小板，連接小鼠的右頸動脈，使小鼠血液流過毛細玻璃管，在活體熒光顯微鏡下觀察白細胞在血小板表面的滾動和粘附情況。
　　 11.血小板的激活，聚集及釋放實驗
　　 分離小鼠血小板后，洗滌血小板，在凝血酶、膠原和ADP刺激下，觀察血小板IKKβ的敲除對血小板激活、聚集和釋放的影響。
　　

32、 12.流式細胞術
　　 利用流式細胞術，對分離血小板的純度進行鑒定，并對血小板表面上的P-選擇素、GPIbα、GPV、GPVI、GPIX、α(II)bβ3等蛋白的量進行檢測。
　　 13.血小板的電鏡觀察
　　 在凝血酶的刺激下，電鏡下觀察血小板的聚集及α顆粒的釋放情況。
　　 14.蛋白印跡實驗
　　 對血小板內在不同刺激下GPIbα、ADAM17、P38及p-P38的蛋白表達，采用west

33、ernblotting的技術進行檢測。
　　 結果：
　　 1.西方飲食12周后，未發(fā)現(xiàn)血小板IKKβ的敲除對自發(fā)性動脈粥樣硬化的形成有明顯的影響(P＞0.05)。
　　 2.血小板IKKβ的敲除，增加了頸動脈損傷后新生血管內膜的厚度，并增加了斑塊內巨噬細胞的含量。骨髓移植實驗，進一步確認了血小板IKKβ的敲除促進了新生血管內膜的增厚。
　　 3.血小板IKKβ的敲除沒有對血小板在血管內皮表面上的粘附產生

34、明顯的影響，但增加了中心粒細胞在損傷血管內皮表面上的粘附。通過活體熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)血小板IKKβ的敲除對白細胞在損傷血管內皮或激活的血小板表面上的滾動沒有明顯的影響，但是明顯增加了粘附在損傷血管內皮或激活的血小板表面上的白細胞的數(shù)量。
　　 4.血小板IKKβ的敲除，減輕了血小板的激活、聚集和釋放:在凝血酶的刺激下，發(fā)現(xiàn)血小板激活的標志P選擇素在IKKβ敲除的血小板中的表達受到明顯的抑制。通過測量血小板的ATP的釋放及電鏡觀

35、察，發(fā)現(xiàn)IKKβ敲除后血小板的聚集和釋放也受到了明顯的抑制。
　　 5.血小板IKKβ的敲除，減少了血小板表面上GPIbα、GPV的脫落，但對血小板表面GPVI、GPIX和α(II)bβ3的含量沒有明顯的影響。
　　 6.通過蛋白印跡技術發(fā)現(xiàn)，血小板IKKβ的敲除能夠減少P-38的磷酸化，阻止ADAM的成熟，進而減少GPIbα的脫落。
　　 結論：
　　 1.血小板IKKβ的敲除能夠促進損傷血管的新生內膜