PCSK9在動脈粥樣硬化形成中的作用及機制研究.pdf

1、枯草溶菌素轉化酶9（proprotein convrtase subtilisin/kexin9，PCSK9）是2003年發(fā)現(xiàn)的一個脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)蛋白，屬于前蛋白酶家族中的第九個成員。研究表明 PCSK9可通過促進肝細胞的低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor, LDLR)降解，調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝，影響血漿LDL-C水平。 PCSK9已經(jīng)成為降脂藥物研發(fā)及動脈粥樣硬化(atherosclerosi

2、s，As)干預的熱門靶點。目前研究主要是闡明了PCSK9通過調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝從而影響血脂，間接參與As發(fā)生。但是，有研究認為除了影響血液LDL-C水平之外，PCSK9對血管壁的直接作用在As發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮重要影響。因此有必要闡明PCSK9在血管壁如何直接參與As發(fā)生及其機制，為揭示PCSK9在As發(fā)病中的作用及機制提供新觀點，并為確立PCSK9作為As治療新靶點提供更充分的科學依據(jù)。
　　血管壁巨噬細胞的脂質(zhì)蓄積及炎癥反應作為

3、As發(fā)生發(fā)展中的關鍵環(huán)節(jié)已得到廣泛認同，抑制巨噬細胞脂質(zhì)蓄積和炎癥反應是干預 As形成的一個重要方向。巨噬細胞主要是通過清道夫受體途徑荷脂，這種方式不受細胞內(nèi)膽固醇濃度的負反饋調(diào)節(jié)，因此可無限制地攝入 ox-LDL并沉積在胞內(nèi)，導致泡沫細胞的形成，進而促進As斑塊的發(fā)展。但PCSK9在巨噬細胞脂質(zhì)代謝中的作用及機制尚待闡明。
　　2010年Lan H等通過基因微陣列分析研究發(fā)現(xiàn)炎癥和應激反應途徑可能受PCSK9的調(diào)控。而我們的前期

4、工作發(fā)現(xiàn)在冠心病患者血漿中PCSK9水平與IL-6、TNF-α水平均呈正相關。巨噬細胞作為動脈粥樣硬化斑塊中的主要炎癥細胞，可分泌大量的炎性因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)，從而導致斑塊的不穩(wěn)定性，加速斑塊的破裂。但PCSK9是否參與巨噬細胞的炎癥因子分泌目前尚不清楚。
　　因此，本研究提出“PCSK9通過參與巨噬細胞的脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌而促進 As發(fā)生發(fā)展”的科學

5、假設。為回答這一科學問題，在第一部分研究中檢測了PCSK9在As斑塊中的表達情況以及是否與巨噬細胞共定位，并觀察了氧化低密度脂蛋白（Oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）對巨噬細胞PCSK9表達的影響；在第二部分研究中，通過構建 PCSK9過表達慢病毒載體和PCSK9-shRNA慢病毒載體，上調(diào)或抑制巨噬細胞 PCSK9表達，觀察 PCSK9表達改變對巨噬細胞脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌的影響，并探索此

6、過程中脂質(zhì)代謝及炎癥反應相關基因表達的變化；在第三部分研究中，采用ApoE-/-小鼠，通過尾靜脈注射PCSK9-shRNA慢病毒載體，并高脂喂養(yǎng)復制As動物模型，在此基礎上觀察了PCSK9-shRNA對ApoE-/-小鼠As病變及其斑塊脂質(zhì)蓄積和局部炎癥的影響，并探討了CD36和TLR4/NF-κB信號通路在此過程中的作用。
　　第一部分，PCSK9在As斑塊巨噬細胞中的表達及oxLDL對巨噬細胞PCSK9表達的影響
　　目

7、的：明確PCSK9在As斑塊中是否表達及與巨噬細胞共定位情況；分析oxLDL對巨噬細胞PCSK9表達的影響。
　　方法：取尸檢的人As斑塊以及ApoE-/-小鼠As斑塊，采用免疫組織化學法檢測斑塊中PCSK9的表達，免疫熒光雙標技術檢測PCSK9在斑塊中與巨噬細胞共定位情況；培養(yǎng)人 THP-1巨噬細胞和小鼠 RAW264.7巨噬細胞，采用免疫熒光細胞化學方法檢測PCSK9在兩種巨噬細胞中的表達情況；最后，用不同濃度ox-LDL處理

8、兩種巨噬細胞不同時間，實時定量PCR和Western blotting檢測細胞PCSK9 mRNA及蛋白質(zhì)的表達。
　　結果：免疫組織化學檢測結果顯示As斑塊中PCSK9呈陽性表達，陽性染色的區(qū)域主要分布在斑塊增生的內(nèi)膜中，而在正常主動脈中未見PCSK9明顯表達；免疫熒光雙標技術檢測結果顯示 As斑塊中PCSK9陽性表達區(qū)域與巨噬細胞特異性抗原CD68陽性表達區(qū)域基本一致；免疫熒光細胞化學方法檢測結果顯示，PCSK9在人THP-1

9、巨噬細胞和小鼠RAW264.7巨噬細胞均陽性表達，呈紅色熒光，主要分布在細胞胞漿中；實時定量PCR和Western blotting結果顯示， oxLDL呈濃度依賴性上調(diào)兩種巨噬細胞PCSK9 mRNA和蛋白質(zhì)表達，而50μg/ml oxLDL分別處理巨噬細胞不同時間后，PCSK9 mRNA和蛋白質(zhì)表達也上調(diào)，呈時間依賴性。
　　小結：① PCSK9在As斑塊中存在表達且與巨噬細胞共定位；②巨噬細胞中存在PCSK9表達，oxLDL

10、呈濃度和時間依賴性上調(diào)巨噬細胞中PCSK9表達。
　　第二部分，PCSK9對oxLDL誘導的巨噬細胞脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌的影響及機制
　　目的：觀察PCSK9表達改變對oxLDL誘導的巨噬細胞脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌的影響及其調(diào)控分子機制。
　　方法：1.根據(jù)設計的PCSK9基因 RNA干擾靶序列，合成靶序列的雙鏈DNA，接入GV115慢病毒載體，構建PCSK9-shRNA慢病毒載體；利用PCR方法獲得小鼠PCSK9基

11、因，并將其連接入GV287慢病毒載體，構建PCSK9過表達慢病毒載體；采用菌落 PCR和DNA測序?qū)嫿ǖ妮d體進行鑒定后，分別與pHelper1.0載體和pHelper2.0載體共同轉染293T細胞，包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒，采用熒光法或?qū)崟r定量 PCR測定病毒滴度；兩種慢病毒顆粒分別感染體外培養(yǎng)的小鼠 RAW264.7巨噬細胞，實時定量 PCR和/或 Western blotting檢測細胞PCSK9表達。2.以PCSK9-shRNA慢病毒

12、載體、PCSK9過表達慢病毒載體和/或oxLDL處理RAW264.7巨噬細胞，油紅O染色、Filipin染色法檢測巨噬細胞膽固醇蓄積， ELISA檢測細胞炎癥因子分泌。3.以PCSK9-shRNA慢病毒載體、PCSK9過表達慢病毒載體分別轉染RAW264.7巨噬細胞，加或不加oxLDL處理，采用實時定量PCR或Western blotting檢測巨噬細胞清道夫受體CD36、SR-AI、SR-BI和炎癥反應相關基因TLR4表達以及NF-κ

13、B活性。
　　結果：1.菌落PCR和DNA測序證實，PCSK9-shRNA慢病毒載體和PCSK9過表達慢病毒載體構建正確，病毒滴度分別為5.0×108 TU/ml和2.0×108 TU/ml；實時定量PCR和/或Western blotting結果顯示，PCSK9-shRNA慢病毒明顯抑制了RAW264.7巨噬細胞 PCSK9表達，而 PCSK9過表達慢病毒大幅度增加了RAW264.7巨噬細胞 PCSK9表達。2.油紅 O染色和F

14、ilipin染色結果顯示，與oxLDL單獨處理組相比，PCSK9低表達組細胞內(nèi)膽固醇蓄積明顯減少，而PCSK9過表達組細胞內(nèi)膽固醇蓄積則明顯增多；ELISA檢測結果顯示PCSK9低表達能抑制oxLDL誘導的RAW264.巨噬細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1分泌，而PCSK9過表達能促進oxLDL誘導的RAW264.巨噬細胞炎癥因子分泌。3.實時定量PCR結果顯示，PCSK9低表達或過表達對巨噬細胞SR-AI、SR

15、-BI mRNA表達均無影響，而CD36和TLR4 mRNA表達在PCSK9干擾時下調(diào)，在PCSK9過表達時上調(diào)；Western blotting結果顯示，PCSK9低表達及過表達對oxLDL誘導的RAW264.巨噬細胞SR-AI和SR-BI蛋白質(zhì)表達的改變無明顯的影響，但PCSK9低表達能抑制oxLDL誘導的RAW264.巨噬細胞CD36、TLR4蛋白質(zhì)表達的上調(diào)，而PCSK9過表達能加劇這一效應，結果還顯示，PCSK9低表達可以抑制

16、oxLDL誘導的巨噬細胞p-IkBα表達上調(diào)、IkBα的降解以及NF-κB核轉位，而PCSK9過表達的作用則與其相反。
　　小結：①成功構建PCSK9過表達和干擾慢病毒載體；② PCSK9高表達能促進巨噬細胞脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌，PCSK9低表達則起抑制作用；③PCSK9促進巨噬細胞脂質(zhì)蓄積和炎癥因子分泌與其上調(diào) CD36表達以及激活TLR4/NF-κB信號通路有關。
　　第三部分，LV-PCSK9 shRNA對apoE-

17、/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊脂質(zhì)蓄積和局部炎癥因子表達的影響及機制研究
　　目的：探索LV-PCSK9shRNA對ApoE-/-小鼠As斑塊脂質(zhì)蓄積和局部炎癥因子表達的影響及其機制。
　　方法：6周齡雄性ApoE-/-小鼠30只適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為兩組：對照組、LV-PCSK9 shRNA組，每組15只，其中LV-PCSK9 shRNA組通過尾靜脈注射LV-PCSK9 shRNA，每只鼠注射量為4×107TU/次，每6周一

18、次。兩組小鼠予以高脂喂養(yǎng)，12周后處死動物，采用熒光顯微鏡觀察LV-PCSK9 shRNA轉染情況；分別采用免疫組織化學法、實時定量PCR及Western blotting檢測主動脈PCSK9基因表達情況；全自動生化分析儀檢測各組小鼠血脂水平；體視顯微鏡下觀察、蘇丹Ⅳ染色及HE染色檢測主動脈粥樣硬化病變面積；油紅O染色、Masson染色以及Filipin染色三種方法檢測主動脈竇As病變處脂質(zhì)蓄積的情況；免疫熒光和免疫組織化學法檢測斑塊巨

19、噬細胞浸潤情況；實時定量 PCR和免疫組織化學法檢測主動脈TNF-α、IL-1β和MCP-1的表達；免疫組織化學或熒光法、實時定量PCR和Western blotting檢測主動脈CD36、TLR4及NF-κB的表達。
　　結果：熒光顯微鏡觀察顯示主動脈存在GFP表達；LV-PCSK9 shRNA成功敲減了ApoE-/-小鼠主動脈中PCSK9基因的表達；與對照組相比， LV-PCSK9 shRNA組ApoE-/-小鼠血脂水平無明顯

20、改變，但主動脈粥樣硬化病變面積明顯減少；油紅O染色、Masson染色以及Filipin染色分析結果顯示LV-PCSK9 shRNA可減少 ApoE-/-小鼠主動脈竇 As病變處脂質(zhì)蓄積；與對照組相比，LV-PCSK9 shRNA組主動脈炎癥因子TNF-α、IL-1β和MCP-1 mRNA的表達以及主動脈竇As斑塊處TNF-α、IL-1β和MCP-1蛋白質(zhì)的分泌減少，并且主動脈竇As斑塊中巨噬細胞浸潤減少，而免疫組織化學法、實時定量PCR