乳酸桿菌對(duì)ApoE---小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:心血管疾病是世界范圍內(nèi)致病率和致死率主要的原因，動(dòng)脈粥樣硬化是心血管病的病理基礎(chǔ)。降脂治療是防治心血管疾病的一種常規(guī)手段，常用的降脂藥由于是化學(xué)合成的藥物，各有其副作用和不良反應(yīng)，臨床上迫切需要療效更好更安全的降膽固醇藥。乳酸桿菌從公元3世紀(jì)起即被人們用于發(fā)酵食物，悠久的使用歷史證明了乳酸桿菌是一種安全的益生菌并具有多種功效。從20世紀(jì)六七十年代起人們開(kāi)始關(guān)注乳酸桿菌的降膽固醇作用并迅速成為益生菌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。然而，乳酸桿菌

2、降膽固醇的效果一直存在爭(zhēng)議，有關(guān)乳酸桿菌對(duì)心血管疾病作用的研究非常有限，而直接研究乳酸桿菌對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成影響的報(bào)道更加少。目的:研究嗜酸乳酸桿菌ATCC4356對(duì)ApoE-/-小鼠血清膽固醇和動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響并從乳酸桿菌對(duì)炎癥、氧化應(yīng)激和腸道菌群的調(diào)節(jié)三方面闡明可能的機(jī)制。方法:(1)實(shí)驗(yàn)對(duì)象分組和飼養(yǎng):野生型C57BL/6J小鼠灌胃生理鹽水作為正常對(duì)照組（WT組）;選取ApoE-/-小鼠為動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型，ApoE-/-

3、小鼠灌胃生理鹽水作為動(dòng)脈粥樣硬化模型對(duì)照組（Vehicle組）;ApoE-/-小鼠灌胃5×107CFU嗜酸乳酸桿菌ATCC4356作為菌液低劑量組（La.L組）;ApoE-/-小鼠灌胃5×108CFU嗜酸乳酸桿菌ATCC4356組作為菌液高劑量組(La.H組)。小鼠均為8周齡的雄性小鼠，每天灌胃體積為0.5mL，連續(xù)12周。WT組小鼠飼料為普通飼料，ApoE-/-小鼠用高脂高膽固醇飼料（含15％豬油+0.25％膽固醇）喂養(yǎng)以加速動(dòng)脈粥樣

4、硬化模型的形成。
　　(2)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，定期記錄小鼠體重并觀察體重變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將小鼠麻醉處死、取材、保存。(3)檢測(cè)乳酸桿菌對(duì)血清膽固醇的影響:利用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽固醇(totalcholesterol，TC)、甘油三酯(tryglyeride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensitylipoproteincholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(lowdensitylipoprotein

5、cholesterol，HDL-C)的水平。(4)檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化形成情況:對(duì)小鼠主動(dòng)脈大體和主動(dòng)脈根部冰凍切片行油紅O染色，對(duì)動(dòng)脈粥樣斑塊面積進(jìn)行定量;對(duì)主動(dòng)脈根部切片進(jìn)行H&E染色觀察粥樣斑塊的病理變化。(5)檢測(cè)氧化應(yīng)激分子的變化:用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測(cè)各組小鼠血清中氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein，o

6、x-LDL)的水平，用生化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠血清和肝臟中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)和谷胱甘肽(Glutathione，GSH)的水平。(6)檢測(cè)炎癥因子的變化:采用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清腫瘤壞死因子-α(Tumornecrosisfactoralpha，TNF-α)和白介素-10(Interleukin10，IL-10)的蛋白水平;采用實(shí)時(shí)熒光定

7、量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-timepolymerasechainreaction，real-timePCR)檢測(cè)各組小鼠主動(dòng)脈的TNF-α和IL-10的mRNA表達(dá)水平;(7)檢測(cè)核因子P65(nuclearfactorkappaB，NF-κBP65)信號(hào)通路的激活情況:用westernblot檢測(cè)總蛋白核因子κB抑制蛋白α蛋白(nuclearfactor-kappa-Binhibitoralpha，IκB-α)、胞漿蛋白和胞核蛋白N

8、F-κBP65的蛋白表達(dá)水平。(8)檢測(cè)小鼠腸道菌群的變化:對(duì)小鼠糞便進(jìn)行倍比稀釋后，利用選擇性培養(yǎng)基，Mac用于大腸桿菌、EC用于腸球菌、MRS用于乳酸桿菌和BS用于雙岐桿菌的分離培養(yǎng)并進(jìn)行菌落的鑒定和計(jì)數(shù)。用MTT方法檢測(cè)嗜酸乳酸桿菌ATCC4356對(duì)腸上皮細(xì)胞Caco-2細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型。(2)小鼠體重的變化:高脂高膽固醇喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠體重增加要大于普通飲食喂養(yǎng)的野生型C57BL/

9、6J小鼠，但是嗜酸乳酸桿菌ATCC4356對(duì)小鼠體重沒(méi)有影響。(3)乳酸桿菌對(duì)膽固醇的影響:ApoE-/-小鼠血清的LDL-C、TC和HDL-C都顯著高于WT組，但是乳酸桿菌對(duì)ApoE-/-小鼠的血清膽固醇并沒(méi)有影響。(4)粥樣斑塊的形成情況:高脂高膽固醇喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)可以形成明顯的動(dòng)脈粥樣斑塊病變，給予乳酸桿菌處理的小鼠，動(dòng)脈粥樣斑塊面積減少，病變減輕，La.H組與Vehicle組比較有顯著性差異（P＜0.05）

10、。(5)氧化應(yīng)激分子的檢測(cè)結(jié)果:與WT組相比，Vehicle組小鼠的血清ox-LDL、MDA顯著升高，SOD活力降低，用嗜酸乳酸桿菌ATCC4356干預(yù)可以降低ox-LDL、MDA水平，并增加SOD活性，但對(duì)GSH無(wú)影響。(6)炎癥分子的變化結(jié)果:乳酸桿菌可以降低血清TNF-α水平，La.H組與Vehicle組比有顯著性差異（P＜0.05），但是對(duì)IL-10的蛋白含量無(wú)影響。Real-timePCR結(jié)果顯示，與WT組小鼠相比，Vehic

11、le組小鼠主動(dòng)脈TNF-αmRNA表達(dá)水平增高，IL-10mRNA表達(dá)水平減低，嗜酸乳酸桿菌ATCC4356干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)這些變化。(8)NF-κB信號(hào)通路的激活情況:WesternBlot結(jié)果顯示，Vehicle組小鼠主動(dòng)脈總蛋白IκB-α蛋白降解顯著，胞漿NF-κBP65蛋白表達(dá)減少，胞核NF-κBP65蛋白表達(dá)增加，應(yīng)用嗜酸乳酸桿菌ATCC4356處理后，IκB-α蛋白降解減少，胞漿NF-κBP65蛋白表達(dá)增加，胞核NF-κBP65

12、蛋白表達(dá)減少，提示NF-κBP65核轉(zhuǎn)位減少。(9)腸道菌群的改變結(jié)果:高脂高膽固醇喂養(yǎng)的Vehicle組ApoE-/-小鼠與普通飲食喂養(yǎng)的WT組小鼠相比，腸道內(nèi)容物中雙岐桿菌、乳酸桿菌數(shù)量減少，大腸桿菌數(shù)量增加，腸球菌數(shù)量無(wú)明顯改變。給ApoE-/-小鼠灌胃嗜酸乳酸桿菌ATCC4356菌液12周后，小鼠腸道內(nèi)容物的雙岐桿菌、乳酸桿菌和腸球菌數(shù)量增加，大腸桿菌數(shù)量減少。MTT結(jié)果顯示1×108CFU/mL的嗜酸乳酸桿菌ATCC4356可