不同PKC亞型對(duì)KCNQ1通道蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制.pdf

1、延遲整流鉀電流（IK）是哺乳動(dòng)物和人的心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極主要的外向鉀電流，按照通道動(dòng)力學(xué)特征將IK區(qū)分為快激活（IKr）和緩慢激活I(lǐng)Ks）兩種成分。其中，IKs通道的孔區(qū)α-亞單位由KCNQ1基因編碼、β-亞單位由KCNE1基因編碼?，F(xiàn)已明確，先天性KCNQ1和KCNE1基因突變可致IKs增大或減小，分別引發(fā)長(zhǎng)QT綜合征（LQT）和短QT綜合征（SQT）。心臟疾病如心肌缺血、心肌肥厚、慢性心力衰竭等均伴隨IKs的減小，表現(xiàn)為獲得性L

2、QT。LQT和SQT均以高發(fā)室性心律失常為特征。因此，研究KCNQ1/KCNE1通道的功能調(diào)節(jié)具有重要意義。
　　越來(lái)越多的證據(jù)表明，催化磷酸化反應(yīng)的蛋白磷酸激酶C（PKC）家族與KCNQ1/KCNE1通道的功能調(diào)控相關(guān)，但迄今關(guān)于PKC對(duì)IKs的調(diào)節(jié)報(bào)道不盡相同，有增加和減小兩種相反的結(jié)果。已知PKC家族按照結(jié)構(gòu)和激活方式的不同可以分為傳統(tǒng)型PKC（cPKC，包括α、βI、βII和γ），新型PKC（nPKC，包括δ、ε、π和θ）

3、和非典型PKC（aPKC，包括ζ、ι/λ）三大類，而不同動(dòng)物種屬的心肌組織均存在PKCα、βI、βII、θ、δ、γ等亞型。很可能上述PKC對(duì)IKs的不同調(diào)節(jié)現(xiàn)象是因?yàn)榧せ畹腜KC亞型不同所致。離子通道電流的大小取決于通道孔的通透性、開放概率以及細(xì)胞膜上通道數(shù)量，調(diào)節(jié)后者的因素涉及基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、轉(zhuǎn)運(yùn)以及降解等環(huán)節(jié)。其中蛋白的正向轉(zhuǎn)運(yùn)與降解平衡是決定細(xì)胞膜上通道數(shù)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前，不同PKC亞型如何調(diào)控細(xì)胞膜通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)與降解從而影

4、響細(xì)胞膜上通道數(shù)量尚不清楚。
　　因此，本研究主要在分子生物學(xué)水平，利用非選擇性PKC激動(dòng)劑和連接透膜序列的選擇性PKC激動(dòng)肽，在異源表達(dá)系統(tǒng)上研究不同PKC亞型對(duì)細(xì)胞膜上KCNQ1表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用，并且探究其調(diào)節(jié)作用的機(jī)制。這對(duì)理解心肌離子通道的病理重構(gòu)機(jī)制具重要意義，也將為發(fā)現(xiàn)以PKC亞型為靶點(diǎn)的新型抗心律失常藥物提供重要的理論依據(jù)。
　　第一部分不同PKC亞型對(duì)KCNQ1蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)作用。
　　目的：在構(gòu)建的穩(wěn)

5、定表達(dá)KCNQ1/KCNE1通道的HEK293細(xì)胞系上，研究不同PKC亞型對(duì)KCNQ1總蛋白、細(xì)胞膜蛋白表達(dá)水平的影響。
　　方法：
　　1.全細(xì)胞蛋白提?。杭?xì)胞漂洗后輕輕刮下并離心，收集細(xì)胞沉淀，按照RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑（PMSF）以100:1的比例加入并使細(xì)胞沉淀充分混懸，冰上超聲破碎后靜置裂解，離心收集上清液。
　　2.細(xì)胞膜蛋白提取：利用生物素?；姆椒?biāo)記細(xì)胞膜蛋白，充分裂解破碎細(xì)胞后，借助珠子特異性

6、結(jié)合的方式將生物素標(biāo)記的膜蛋白分離，其余成份離心丟棄，再經(jīng)洗脫，得到純凈的細(xì)胞膜蛋白成份。
　　3.Western blot：對(duì)提取的全細(xì)胞蛋白或者細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用TBST配制含10％脫脂奶粉的封閉液進(jìn)行封閉，通過(guò)特異性的一抗與紅外熒光標(biāo)記的二抗結(jié)合，用ODYSSEY雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器進(jìn)行曝光成像。
　　4.siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：采用Lipofectin RNAmax試劑

7、盒進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，鋪板后24小時(shí)，細(xì)胞匯合度達(dá)到50%-60%時(shí)可進(jìn)行siRNA的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染4小時(shí)左右后換完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，siRNA表達(dá)完成，可進(jìn)行下一步處理。
　　結(jié)果：
　　1.不同PKC亞型對(duì)全細(xì)胞KCNQ1蛋白表達(dá)水平的影響：利用非選擇性PKC激動(dòng)劑PMA（100 nM）、OAG（10μM）和選擇性cPKC激動(dòng)肽（200 nM）、PKCε激動(dòng)肽（200 nM）分別孵育24小時(shí)，Western blo

8、t檢測(cè)全細(xì)胞KCNQ1蛋白表達(dá)沒有明顯變化。
　　2.不同PKC亞型對(duì)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平的影響：首先，驗(yàn)證細(xì)胞膜蛋白提取方法的敏感性。采用陽(yáng)性對(duì)照藥地塞米松（50 nM）（已被證實(shí)通過(guò)抑制蛋白泛素化降解，顯著增加細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平）孵育6、24小時(shí)后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平分別是對(duì)照的176%和281%，證明實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞膜蛋白提取方法敏感性較好。
　　PMA、OAG以及cPKC激動(dòng)肽

9、、PKCε激動(dòng)肽分別與細(xì)胞孵育6、24小時(shí)，Western blot檢測(cè)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，PMA孵育后細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平分別是對(duì)照的36%和24%；cPKC激動(dòng)肽孵育后，細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平分別是對(duì)照的24%和30%；PKCε激動(dòng)肽孵育后細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平是對(duì)照的34%和34%；而OAG孵育后，細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。
　　3.siRNA敲低不同PKC亞型對(duì)激動(dòng)肽

10、作用的影響：利用siRNA干擾技術(shù)，敲低不同PKC亞型表達(dá)，觀察對(duì)上述PKC亞型激動(dòng)肽作用的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證其作用的特異性。結(jié)果顯示，敲低細(xì)胞PKC和β亞型可逆轉(zhuǎn)cPKC激動(dòng)肽下調(diào)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)的作用，未敲低為對(duì)照的48%，而敲低PKC和β亞型后為對(duì)照的94%。與此相似，敲低PKCε亞型后PKCε激動(dòng)肽對(duì)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)的下調(diào)作用顯著減弱，未敲低為對(duì)照的33%，而敲低PKCε亞型后為對(duì)照的68%。因此，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明P

11、KC亞型特異性調(diào)節(jié)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)的作用。
　　小結(jié)：在異源表達(dá)系統(tǒng)上， PMA、cPKC和PKCε激動(dòng)肽對(duì)全細(xì)胞KCNQ1蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，而對(duì)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)明顯下調(diào)作用，提示PKC通過(guò)調(diào)節(jié)通道的轉(zhuǎn)運(yùn)與降解過(guò)程影響細(xì)胞膜上的通道表達(dá)水平。
　　第二部分不同PKC亞型對(duì)細(xì)胞膜KCNQ1表達(dá)調(diào)節(jié)作用的機(jī)制
　　目的：探究激活cPKC亞型和PKCε亞型后下調(diào)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用機(jī)制。

12、
　　方法：觀察選擇性干擾細(xì)胞膜通道蛋白內(nèi)吞、降解和正向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的工具藥對(duì)PKC亞型激動(dòng)肽作用的影響，分析激活不同PKC亞型對(duì)上述過(guò)程的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞膜蛋白提取和Western blot方法同第一部分。
　　結(jié)果：
　　1.對(duì)細(xì)胞膜蛋白內(nèi)吞過(guò)程影響：觀察內(nèi)吞抑制劑Dynasore（80μM）對(duì)激活不同PKC亞型作用的影響。結(jié)果顯示，PMA與Dynasore共同孵育6小時(shí)后對(duì)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)的下調(diào)作用被明顯抑制，

13、單獨(dú)孵育表達(dá)水平為對(duì)照的34%，而共同孵育為對(duì)照的89%；與此相似，cPKC激動(dòng)肽與Dynasore共同孵育對(duì)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)的下調(diào)作用同樣被明顯抑制，單獨(dú)孵育表達(dá)水平為對(duì)照的24%，而共同孵育為對(duì)照的89%。上述結(jié)果表明PMA和cPKC激動(dòng)肽通過(guò)促進(jìn)馬達(dá)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑使細(xì)胞膜KCNQ1蛋白加速降解而發(fā)揮下調(diào)作用。與此相反，PKCε激動(dòng)肽與Dynasore共同孵育對(duì)KCNQ1細(xì)胞膜蛋白表達(dá)的下調(diào)作用未受影響，單獨(dú)孵育表達(dá)水平

14、為對(duì)照的29%，而共同孵育表達(dá)水平為對(duì)照的39%，提示PKCε激動(dòng)肽并非通過(guò)影響內(nèi)吞過(guò)程減少細(xì)胞膜KCNQ1表達(dá)水平。此外，單獨(dú)孵育Dynasore并不明顯改變細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平，可能是其他代償?shù)姆绞綇浹a(bǔ)了馬達(dá)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑阻斷所帶來(lái)的影響。
　　2.對(duì)細(xì)胞膜蛋白降解的影響：加入正向轉(zhuǎn)運(yùn)阻斷劑Brefeldin A（BFA）（10μM）后利用Western blot檢測(cè)不同時(shí)間細(xì)胞膜上KCNQ1蛋白表達(dá)水平，可以反映

15、出通道細(xì)胞膜蛋白降解速度。結(jié)果顯示，以各自0小時(shí)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平為100%，BFA對(duì)照組孵育6、24小時(shí)分別是0小時(shí)的72%和39%，cPKC激動(dòng)肽共孵育分別是30%和14%，與對(duì)照相比降解顯著增多；而PKCε激動(dòng)肽共孵育分別是68%和33%，降解程度與對(duì)照相比無(wú)明顯差別。結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了激活cPKC亞型通過(guò)加速內(nèi)吞降解過(guò)程下調(diào)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平，而激活PKCε亞型對(duì)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)的下調(diào)作用則可能是通過(guò)抑

16、制蛋白正向轉(zhuǎn)運(yùn)或者再循環(huán)過(guò)程而實(shí)現(xiàn)的。與此類似，也觀察了PMA對(duì)蛋白降解的影響。結(jié)果顯示，BFA對(duì)照組孵育后細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平分別是0小時(shí)的82%和32%，而PMA共孵育分別是45%和14%，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的降解程度均顯著高于對(duì)照，表明PMA也通過(guò)加速內(nèi)吞降解過(guò)程來(lái)下調(diào)細(xì)胞膜KCNQ1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果提示盡管PMA為非選擇性PKC激動(dòng)劑，但其作用機(jī)制與cPKC亞型相似，可能在此實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)PMA主要通過(guò)激活cPKC亞型下調(diào)細(xì)胞膜KC