BK通道α與β2亞基結(jié)合位點(diǎn)以及KCNE2調(diào)節(jié)KCNQ1通道上膜機(jī)制的研究.pdf

1、離子通道是成孔的膜蛋白，它們不僅可以通過門控進(jìn)出細(xì)胞的離子來調(diào)節(jié)細(xì)胞的電活動(dòng)，還可以調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的離子流動(dòng)，甚至對(duì)維持細(xì)胞的體積都有重要作用。鉀離子通道是分布最廣泛的一類離子通道，它們調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生理功能。BK和KCNQ1通道是兩種非常重要的鉀離子通道，也是我們研究的重點(diǎn)。本文的主要內(nèi)容圍繞以上兩種鉀離子通道可以分為以下兩個(gè)部分：
　　1）BK通道α和β2亞基結(jié)合位點(diǎn)的研究
　　大電導(dǎo)的、Ca2+和電壓激活的鉀離子通道（B

2、K通道），作為膜電位和胞內(nèi) Ca2+濃度的雙重感受器，在興奮細(xì)胞中調(diào)節(jié)多種電活動(dòng)，并調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。在BK通道的輔助亞基中，β2亞基不僅增強(qiáng)了通道對(duì)Ca2+的敏感性，而且使通道發(fā)生失活。另外，已有證據(jù)證明在BK(β2)通道失活的過程中，在開放態(tài)（O）和失活態(tài)（I）之間存在一個(gè)非常短暫的電導(dǎo)狀態(tài)，稱為預(yù)失活態(tài)（O*）。對(duì)BK通道α和β2亞基相互作用的研究一直不斷，但是兩個(gè)亞基之間具體的結(jié)合位點(diǎn)一直不知道，預(yù)失活態(tài)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)也一直未

3、知。
　　在研究中，我們發(fā)現(xiàn)β2的一個(gè)突變體dFIW-hβ2，可以抑制BK通道α亞基mSlo1在細(xì)胞膜上的表達(dá)，并將其滯留胞內(nèi)。利用dFIW-hβ2這一特性，我們開發(fā)了一種新的方法來研究mSlo1和hβ2亞基之間的結(jié)合位點(diǎn)，即在mSlo1和dFIW-hβ2上構(gòu)建一系列突變，通過定量免疫熒光技術(shù)測(cè)量 mSlo1在細(xì)胞膜上表達(dá)水平的變化來鑒定兩者的結(jié)合位點(diǎn)。最終我們?cè)趍Slo1的胞內(nèi)C端和hβ2的胞內(nèi)N端部分發(fā)現(xiàn)了兩對(duì)互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，

4、即 mSlo1(K392/R393)::hβ2(E44/D45)和 mSlo1(K330/K331)::hβ2(D16/E17)，并用“雙突變循環(huán)法”做了進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，利用一個(gè)證明 BK(hβ2)通道存在預(yù)失活態(tài)的突變體 hβ2(W4E)，我們證明 mSlo1(K330/K331)::hβ2(D16/E17)這一對(duì)互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)即為通道預(yù)失活態(tài)存在的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。最后，基于BK(mSlo1α) C端的晶體結(jié)構(gòu)，我們重建了BK(hβ2)通

5、道復(fù)合體的結(jié)構(gòu)模型，該模型展示了兩對(duì)互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)可能的作用方式，并為BK通道α與β2亞基之間相互作用的研究提供了重要線索。
　　2）KCNE2調(diào)節(jié)KCNQ1通道上膜機(jī)制的研究
　　電壓門控的KCNQ1通道在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的興奮性中發(fā)揮重要的作用，KCNQ1基因突變會(huì)引發(fā)長(zhǎng) QT綜合征，導(dǎo)致嚴(yán)重的心律不齊、室顫和心臟休克。輔助亞基KCNE2與KCNQ1的結(jié)合會(huì)使KCNQ1通道從一個(gè)延遲整流的鉀離子通道變成一個(gè)類似背景的鉀離子漏通

6、道。已有報(bào)道稱KCNE2會(huì)降低KCNQ1通道的電流振幅和電流密度，但是具體的原因和機(jī)制一直未知曉。
　　本文發(fā)現(xiàn) KCNE2降低 KCNQ1通道電流振幅和電流密度的原因是其抑制了KCNQ1通道在細(xì)胞膜上的表達(dá)，并將其滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。通過構(gòu)建KCNE1/KCNE2的嵌合體，并用定量免疫熒光成像技術(shù)和電生理技術(shù)分別統(tǒng)計(jì)了它們?cè)诩?xì)胞膜上的表達(dá)量和電流密度，發(fā)現(xiàn)KCNE2的N端是抑制KCNQ1在細(xì)胞膜上表達(dá)的主要原因。為了進(jìn)一步探索 KC

7、NE2 N端抑制 KCNQ1通道在細(xì)胞膜上表達(dá)的機(jī)制，我們?cè)贙CNE2的N端構(gòu)建了一系列的突變和truncation，并將其與KCNQ1共表達(dá)。發(fā)現(xiàn)將KCNE2 N端的兩種突變體，即去掉疏水氨基酸或者切掉25–29氨基酸片段，與KCNQ1共表達(dá)時(shí)，KCNQ1的上膜表達(dá)水平都有了一定程度的恢復(fù)。當(dāng)將疏水氨基酸和25–29氨基酸片段同時(shí)去掉時(shí)，KCNQ1的上膜表達(dá)量幾乎完全恢復(fù)。以上結(jié)果說明KCNE2調(diào)節(jié)KCNQ1通道的上膜表達(dá)很可能是通過