瑞替加濱逆轉(zhuǎn)局麻藥對KCNQ2-Q3通道電流的作用以及致驚厥作用的研究.pdf

1、第一部分:氯普魯卡因?qū)CNQ2/Q3通道電流的影響以及瑞替加濱的逆轉(zhuǎn)作用
　　 目的:采用細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，研究鹽酸氯普魯卡因?qū)CNQ2/Q3通道電流的影響，以及瑞替加濱是否可以逆轉(zhuǎn)氯普魯卡因?qū)CNQ2/Q3通道電流的作用。
　　 方法:以人胚胎腎（humanembryonickindeyHEK293）細(xì)胞作為表達(dá)體系，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染KCNQ2和KCNQ3鉀離子通道基因到HEK293細(xì)胞上，使細(xì)胞表達(dá)KCNQ2/Q3通

2、道。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，按照不同的刺激程序進(jìn)行電流記錄，實(shí)驗(yàn)分為三步。
　　 首先:觀察不同濃度的氯普魯卡因在不同電壓下對KCNQ2/Q3通道電流的影響。根據(jù)氯普魯卡因的不同濃度分為4組，即0mmol/L(C0組)、1mmol/L（C1組）、10mmol/L（C2組）、100mmol/L（C3組），其中C0組作為對照組，每組觀察11個樣本。細(xì)胞被鉗制在-80mV后分別去極化至-40mV，0mV和+40mV，最后復(fù)極化-80mV

3、。記錄不同濃度不同鉗制電壓下氯普魯卡因?qū)CNQ2/Q3通道電流的影響。
　　 繼而:觀察10mmol/L氯普魯卡因?qū)CNQ2/Q3通道動力學(xué)的影響。細(xì)胞被鉗制在-80mV后以10mV幅度逐步增加去極化電壓，至+30mV電壓水平，維持1s時間后復(fù)極化到-60mV。通過外液灌流給予10mmol/L的氯普魯卡因，0mmol/L氯普魯卡因作為對照，每組觀察5個樣本。不同激活電壓下所得到的去活尾電流統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化后經(jīng)Boltzmann方程

4、擬合，得到KCNQ2/Q3通道電流-激活電壓關(guān)系曲線（即通道Ⅰ-Ⅴ曲線）。單指數(shù)方程對電流的激活段與去活段擬合，計算出KCNQ2/Q3通道激活時間常數(shù)和通道去活時間常數(shù)。
　　 第三步:觀察瑞替加濱存在時100mmol/L氯普魯卡因?qū)CNQ2/Q3通道電流的作用。將細(xì)胞鉗制于-80mV后去極化至0mV，再復(fù)極化至-80mV，細(xì)胞外灌流液含100mmol/L氯普魯卡因的電極外液(C100)或含10μmol/L瑞替加濱(RTG)與

5、100mmol/L氯普魯卡因的電極外液(C100+RTG)，0mmol/L氯普魯卡因(C0)作為對照，每組觀察5個樣本，記錄0mV鉗制電壓下KCNQ2/Q3通道電流。
　　 結(jié)果:1鉗制電壓在+40mV時，C1組、C2組、C3組對KCNQ2/Q3電流的抑制率分別與C0相比，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。鉗制電壓在0mV時，C1組、C2組、C3組對KCNQ2/Q3電流的抑制率分別與C0相比，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。鉗制電壓在

6、-40mV時，C1組、C2組、C3組對KCNQ2/Q3電流的抑制率分別與C0相比，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。2單指數(shù)方程對電流的激活段與去活段擬合顯示，對照組在0mV下通道激活段的時間常數(shù)為(26.9±3.9)ms，給予氯普魯卡因(10mmol/L)后延長至（36.4±4.1）ms;而-80mV下去活段電流，對照組去活時間常數(shù)(71.3±24.7)ms，給予氯普魯卡因（10mmol/L）后縮短為（65.0±15.0）ms(n=5)。

7、上述結(jié)果與對照組相比均具有顯著性差異(P＜0.05）。3不同激活電壓下所得到的去活尾電流統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化后經(jīng)Boltzmann方程擬合，所得到KCNQ2/Q3通道電流-激活電壓關(guān)系曲線（即通道Ⅰ-Ⅴ曲線）顯示，電壓激活曲線向去極化方向移動。氯普魯卡因?qū)CNQ2/Q3通道的半數(shù)最大激活電壓（V1/2）從(-36.8±1.7)mV右移至（-26.1±1.3）mV(P＜0.05)。4100mmol/L氯普魯卡因引起的KCNQ2/Q3通道電流抑制率

8、為(72.90±0.03)％，同時給予瑞替加濱和氯普魯卡因后KCNQ2/Q3通道電流抑制率降為(4.90±0.05)％，兩組對比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:1氯普魯卡因呈濃度依賴性和電壓依賴性抑制KCNQ2/Q3通道電流。2氯普魯卡因?qū)CNQ2/Q3通道動力學(xué)的影響為:延長激活段時間常數(shù)，縮短去活時間常數(shù);使KCNQ2/Q3通道電流激活曲線右移。3瑞替加濱逆轉(zhuǎn)氯普魯卡因?qū)CNQ2/Q3電流的抑制作用。

9、　　 第二部分:瑞替加濱對布比卡因和氯普魯卡因致小鼠驚厥半數(shù)有效劑量和半數(shù)致死劑量的影響
　　 目的:通過探討KCNQ2/Q3通道開放劑瑞替加濱對布比卡因和氯普魯卡因致小鼠驚厥的半數(shù)有效劑量(ED50)和半數(shù)致死劑量(LD50)的影響，研究KCNQ2/Q3通道與局麻藥毒性的關(guān)系。
　　 方法:清潔級雌性昆明種小鼠，體重20～30g。實(shí)驗(yàn)Ⅰ采用隨機(jī)數(shù)字方法將140只小鼠隨機(jī)分為兩組(n=70):對照組（C組）和瑞替加濱組

10、（R組），兩組隨機(jī)分為7個亞組，分別為不同劑量氯普魯卡因組(C+L1組、C+L2組、C+L3組、C+L4組、C+L5組、C+L6組、C+L7組和R+L1組、R+L2組、R+L3組、R+L4組、R+L5組、R+L6組、R+L7組，n=10）。C組和R組腹腔注射0.9％生理鹽水0.005ml/g或瑞替加濱20mg/kg，20min后腹腔內(nèi)注射氯普魯卡因。C+L1組、C+L2組、C+L3組、C+L4組、C+L5組、C+L6組、C+L7組氯普魯

11、卡因劑量分別為150.0、172.5、198.4、228.2、262.4、301.8、346.1mg/kg;R+L1組，R+L2組、R+L3組、R+L4組、R+L5組、R+L6組、R+L7組氯普魯卡因劑量分別為198.4、228.2、262.4、301.8、346.1、398.0、457.7mg/kg。實(shí)驗(yàn)Ⅱ采用隨機(jī)數(shù)字的方法將100只小鼠隨機(jī)分為兩組(n=50):對照組（C組）和實(shí)驗(yàn)組（R組）。兩組隨機(jī)分為4個亞組，分別為不同劑量布比

12、卡因組(C+B1組、C+B2組、C+B3組、C+B4組、C+B5組和R+B1組、R+B2組、R+B3組、R+B4組、R+B5組，n=10)。C組和R組腹腔注射0.9％生理鹽水0.005ml/g或瑞替加濱20mg/kg，20min后腹腔注射布比卡因。C+B1組、C+B2組、C+B3組、C+B4組、C+B5組布比卡因劑量分別37.8、43.5、50.0、57.5、66.1mg/kg;R+B1組、R+B2組、R+B3組、R+B4組布比卡因劑量

13、分別為50.0、57.5、66.1、76.0、87.4mg/kg。采用Probit法計算布比卡因和氯普魯卡因致小鼠驚厥的ED50及其95％可信區(qū)間、LD50及其95％可信區(qū)間。
　　 結(jié)果:C組氯普魯卡因致小鼠驚厥的ED50及其95％可信區(qū)間為165.3(155.8～175.0)mg/kg，LD50及其95％可信區(qū)間為316.5(290.4～354.3)mg/kg;布比卡因致小鼠驚厥的ED50及其95％可信區(qū)間為41.1(36.

14、7～44.5)mg/kg，LD50及其可信區(qū)間為58.9(54.7～64.4)mg/kg。R組氯普魯卡因致小鼠驚厥的ED50及其95％可信區(qū)間為212.4(200.2～224.3)mg/kg，LD50及其95％可信區(qū)間為402.8(371.0～447.4)mg/kg;布比卡因致小鼠驚厥的ED50及其95％可信區(qū)間為51.5(45.1～56.0)mg/kg，LD50及其可信區(qū)間為77.8(71.8～84.9)mg/kg。與C組比較，R組氯

15、普魯卡因和布比卡因致小鼠驚厥的ED50、LD50均升高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:①KCNQ2/Q3通道開放劑瑞替加濱可明顯提高氯普魯卡因和布比卡因的致驚厥的ED50，降低氯普魯卡因和布比卡因的致驚厥作用。②KCNQ2/Q3通道開放劑瑞替加濱可明顯提高氯普魯卡因和布比卡因半數(shù)致死量，降低氯普魯卡因和布比卡因的致死率。
　　 第三部分:瑞替加濱抗左布比卡因的驚厥作用對腦電圖β頻段功率譜的影響
　　 目的:觀察瑞

16、替加濱在治療左布比卡因誘發(fā)驚厥中的作用以及對驚厥家兔腦電圖β頻段的影響，探討瑞替加濱對局麻藥致驚厥后的作用。
　　 方法:健康新西蘭雄性大白兔20只隨機(jī)分成瑞替加濱組（R組）和對照組（C組），以8ml/(kg×h)的速度耳緣靜脈泵入0.5％的左布比卡因，直至家兔出現(xiàn)強(qiáng)直驚厥、腦電圖出現(xiàn)癲癇波。強(qiáng)直驚厥出現(xiàn)后立即靜脈注射瑞替加濱或生理鹽水作為對照。計算兩組中家兔驚厥出現(xiàn)時所需要的左布比卡因的量，觀察兩組中家兔驚厥的持續(xù)時間以及家兔

17、癲癇波的持續(xù)時間，并連續(xù)監(jiān)測血氧飽和度、心率和腦電圖，分析腦電圖β頻段功率譜的變化。
　　 結(jié)果:1兩組中致家兔出現(xiàn)強(qiáng)直驚厥所需要的0.5％左布比卡因量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組中家兔強(qiáng)直持續(xù)時間和癲癇波持續(xù)時間均明顯縮短(P＜0.01)。2腦電圖變化與行為學(xué)表現(xiàn)同步。β頻段:與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組β頻段能量百分比在處理后1～15min內(nèi)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。處理后20～30min，對照組和實(shí)驗(yàn)

18、組β頻段能量相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與基礎(chǔ)值相比，生理鹽水組在處理后的30min內(nèi)β頻段能量百分比逐漸降低，但仍高于基礎(chǔ)值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義顯著性(P＜0.01)。與基礎(chǔ)值相比，瑞替加濱組β頻段能量百分比在處理后1～15min內(nèi)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:瑞替加濱可以明顯縮短左布比卡因致家兔驚厥后驚厥的持續(xù)時間，可以對抗左布比卡因誘發(fā)的驚厥行為。左布比卡因所引起的系統(tǒng)毒性中，瑞替加濱可以抑