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文檔簡(jiǎn)介
1、缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型,也是成人死亡和殘疾的主要原因之一。腦缺血后繼發(fā)性腦損傷是一個(gè)涉及炎癥、氧化應(yīng)激、鈣超載、興奮性氨基酸中毒、細(xì)胞凋亡等一系列復(fù)雜因素的級(jí)聯(lián)過程,這些因素相互影響,形成對(duì)腦組織的二次打擊,成為病情加重的主要原因。因此,若以上述級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)為靶點(diǎn),抑制缺血半暗帶細(xì)胞的漸進(jìn)性死亡,可能發(fā)揮腦保護(hù)作用,具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
瑞替加濱(retigabine,RTG)目前作為成人部分型癲癇發(fā)作的輔
2、助用藥,具有穩(wěn)定神經(jīng)元靜息膜電位、抗興奮性等特點(diǎn)。除了作為新型抗癲癇藥物,瑞替加濱對(duì)神經(jīng)性疼痛、神經(jīng)退行性病變、肌張力障礙等疾病也具有潛在的臨床治療價(jià)值,同時(shí),在培養(yǎng)的海馬腦片上使用血清剝奪和血氧剝奪的方法,瑞替加濱可發(fā)揮抗氧化作用減少細(xì)胞的死亡。我們假設(shè)在缺血性腦卒中發(fā)生后瑞替加濱通過限制神經(jīng)元放電活動(dòng)保存細(xì)胞能量,減輕缺血情況下的腦損傷。
缺血性腦組織死亡方式除了細(xì)胞壞死還包括細(xì)胞凋亡。缺血性腦卒中發(fā)生后,損傷相對(duì)較輕的半
3、暗帶區(qū)域的細(xì)胞可能經(jīng)歷著由基因調(diào)控的自主有序的死亡,即細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激損傷、過度炎癥反應(yīng)、谷氨酸大量釋放、鈣超載等均有可能觸發(fā)細(xì)胞凋亡信號(hào)使細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”行為。凋亡的細(xì)胞在凋亡性核酸內(nèi)切酶的作用下細(xì)胞的 DNA被降解,形成凋亡小體。研究表明,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)家族成員之一caspase-3是主要的凋亡“執(zhí)行者”,其活化后可以裂解多種
4、功能蛋白質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。缺血性腦卒中發(fā)生后 caspase在腦中的表達(dá)水平升高,抑制 caspase的活化可以減輕缺血性損傷發(fā)揮腦保護(hù)作用。
細(xì)胞凋亡的過程涉及到很多促凋亡相關(guān)因子的表達(dá)及抗凋亡相關(guān)因子的抑制。缺血性腦卒中發(fā)生后,促凋亡蛋白 Bax在腦中的表達(dá)水平升高。抑制 Bax或過表達(dá)抗凋亡蛋白 Bcl-2可以減輕缺血性損傷發(fā)揮腦保護(hù)作用。鈣蛋白酶(calpain)是一類鈣依賴的半胱氨酸肽鏈內(nèi)切酶的總稱,可以感受細(xì)胞內(nèi)升高
5、的鈣離子濃度而被激活,并通過多種途徑引起細(xì)胞凋亡。calpain還可以裂解抗凋亡蛋白 Bcl-2促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制calpain的活性也能發(fā)揮腦保護(hù)作用。
本研究采用健康成年雄性 CD-1小鼠為研究對(duì)象,通過線栓法建立小鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型,給予瑞替加濱干預(yù)后,通過神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積及腦組織含水量測(cè)定,觀察瑞替加濱對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠是否具有腦保護(hù)作用;通過測(cè)定小鼠缺血半暗帶細(xì)胞核 DNA斷裂的情況及 cleav
6、ed caspase-3的蛋白表達(dá)水平觀察瑞替加濱對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦組織凋亡的影響;通過測(cè)定小鼠缺血后腦皮層 Bax、calpain-1及 Bcl-2的表達(dá)情況觀察瑞替加濱對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦組織中促凋亡、抗凋亡因子的影響,探討其可能的相關(guān)作用機(jī)制,為瑞替加濱的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用提供理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為三部分,各部分內(nèi)容概述如下。
第一部分瑞替加濱對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的腦保護(hù)作用
目的:通過對(duì)瑞替加濱干預(yù)
7、后實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積及腦組織含水量測(cè)定,觀察瑞替加濱對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的腦保護(hù)作用。
方法:
1采用健康成年雄性 CD-1小鼠為研究對(duì)象,通過線栓法建立小鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型。將 CD-1小鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組( Sham)、大腦中動(dòng)脈閉塞組( MCAO)、瑞替加濱低劑量組( RTG5)、瑞替加濱中劑量組( RTG10)及瑞替加濱高劑量組(RTG20)。假手術(shù)組小鼠接受假手術(shù)操作
8、后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水;大腦中動(dòng)脈閉塞組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水;瑞替加濱低劑量組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱5mg/kg;瑞替加濱中劑量組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg;瑞替加濱高劑量組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱15mg/kg。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時(shí)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分,2,3,5-氯化三苯
9、基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色測(cè)定腦梗死體積,干濕重法測(cè)定腦組織含水量。
2為進(jìn)一步探討瑞替加濱對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的腦保護(hù)作用時(shí)間窗,我們也觀察了在腦缺血發(fā)生后不同時(shí)間給予瑞替加濱干預(yù)對(duì)小鼠缺血性腦損傷的影響。將 CD-1小鼠隨機(jī)分為5組:大腦中動(dòng)脈閉塞組(MCAO)、瑞替加濱缺血后即刻用藥組(RTG-0h)、瑞替加濱缺血后1小時(shí)用藥組(RTG-1h)、瑞替加濱缺
10、血后2小時(shí)用藥組(RTG-2h)、瑞替加濱缺血后3小時(shí)用藥組(RTG-3h)。大腦中動(dòng)脈閉塞組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù);瑞替加濱缺血后即刻用藥組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后即刻腹腔注射瑞替加濱10mg/kg;瑞替加濱缺血后1小時(shí)用藥組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg;瑞替加濱缺血后2小時(shí)用藥組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后2小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg;瑞替加濱缺血后3小時(shí)用
11、藥組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后3小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg;各組小鼠在不需要瑞替加濱干預(yù)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均腹腔注射等量的生理鹽水。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時(shí) TTC染色測(cè)定腦梗死體積。
結(jié)果:
1 Sham組小鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分均為0,MCAO組小鼠則明顯高于 Sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與 MCAO組小鼠相比, RTG5組和 RTG10組小鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)
12、意義(P<0.05);RTG15組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分較MCAO組小鼠無明顯改變,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
2 Sham組小鼠腦片 TTC染色后呈現(xiàn)均勻一致的紅色,MCAO組小鼠腦片 TTC染色后在右側(cè)皮層及基底節(jié)區(qū)呈現(xiàn)大范圍的白色梗死區(qū)域。與 MCAO組小鼠相比, RTG5組和 RTG10組小鼠的梗死體積明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);RTG15組小鼠的梗死體積較MCAO組小鼠無明顯改變,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意
13、義(P>0.05)。
3腦組織含水量測(cè)定結(jié)果顯示:與 MCAO組小鼠相比,RTG5組和RTG10組小鼠的腦組織含水量明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05);RTG15組小鼠的腦組織含水量較 MCAO組小鼠無明顯改變,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P>0.05)。上述結(jié)果表明瑞替加濱給藥劑量在5mg/kg、10mg/kg時(shí)均能夠較好的發(fā)揮腦保護(hù)作用,接下來的實(shí)驗(yàn)我們將主要關(guān)注瑞替加濱在10mg/kg時(shí)的相關(guān)作用及機(jī)制。
4
14、與 MCAO組小鼠相比,RTG-0h組、RTG-1h組、RTG-2h組及RTG-3h組小鼠的梗死體積明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RTG-0h組、RTG-1h組、RTG-2h組及RTG-h3組小鼠的梗死體積相互比較沒有明顯改變,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。上述結(jié)果表明瑞替加濱10mg/kg在缺血發(fā)生后0-3小時(shí)給藥均能發(fā)揮腦保護(hù)作用。
第二部分瑞替加濱對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響
目的:
15、通過測(cè)定小鼠缺血后半暗帶腦細(xì)胞核 DNA斷裂的情況及cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)水平觀察瑞替加濱對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦細(xì)胞凋亡的影響。
方法:采用健康成年雄性 CD-1小鼠為研究對(duì)象,通過線栓法建立小鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型。將 CD-1小鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組( Sham)、大腦中動(dòng)脈閉塞組( MCAO)、瑞替加濱干預(yù)組(RTG)。假手術(shù)組小鼠接受假手術(shù)操作后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水;大腦中動(dòng)脈閉塞組小鼠
16、接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水;瑞替加濱組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時(shí)TUNEL試劑盒檢測(cè)半暗帶區(qū)域腦細(xì)胞核 DNA斷裂的情況,Western-blot法檢測(cè)cleaved caspase-3蛋白表達(dá)情況。
結(jié)果:
1與 Sham組相比,MCAO組小鼠腦組織切片的 TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于Sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
17、(P<0.05);與MCAO組小鼠相比,RTG組小鼠腦組織切片的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于MCAO組小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
2各組小鼠均有 cleaved caspase-3蛋白的表達(dá);與 Sham組相比, MCAO組小鼠的cleaved caspase-3表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與MCAO組小鼠相比,RTG組小鼠的cleaved caspase-3表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P
18、<0.05)。
第三部分瑞替加濱下調(diào)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦組織 calpain-1、Bax,上調(diào)Bcl-2的表達(dá)
目的:通過測(cè)定實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦皮層calpain-1、Bax及Bcl-2的表達(dá)情況觀察瑞替加濱對(duì)缺血腦細(xì)胞促凋亡、抗凋亡因子的影響,探討其抑制缺血性腦細(xì)胞凋亡可能的作用機(jī)制。
方法:采用健康成年雄性 CD-1小鼠為研究對(duì)象,通過線栓法建立小鼠永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型。將 CD-1小鼠隨機(jī)分為3組:
19、假手術(shù)組( Sham)、大腦中動(dòng)脈閉塞組( MCAO)、瑞替加濱干預(yù)組(RTG)。假手術(shù)組小鼠接受假手術(shù)操作后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水;大腦中動(dòng)脈閉塞組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射等量生理鹽水;瑞替加濱組小鼠接受線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱10mg/kg。各組小鼠于手術(shù)造模后24小時(shí)qRT-PCR檢測(cè) calpain-1、Bax、Bcl-2的 mRNA表達(dá)情況,Western-blot法及免疫組
20、織化學(xué)法檢測(cè)calpain-1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況。
結(jié)果:
1 qRT-PCR結(jié)果顯示:與 Sham組相比,MCAO組小鼠的 calpain-1、Bax的 mRNA表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05);與MCAO組小鼠相比,RTG組小鼠的calpain-1、Bax的mRNA表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與MCAO組小鼠相比,RTG組小鼠的Bcl-2的mRNA表達(dá)明顯升高,差
21、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
2 Western-blot結(jié)果顯示:各組小鼠均有calpain-1、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。與 Sham組相比,MCAO組小鼠的 calpain-1、Bax蛋白表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與MCAO組小鼠相比,RTG組小鼠的 calpain-1、Bax蛋白表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05);與MCAO組小鼠相比,RTG組小鼠的Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高
22、,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
3免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:各組小鼠均有 calpain-1、Bax、Bcl-2陽性細(xì)胞。與 Sham組相比,MCAO組小鼠的 calpain-1、Bax陽性細(xì)胞數(shù)升高;與MCAO組小鼠相比,RTG組小鼠的calpain-1、Bax陽性細(xì)胞數(shù)降低;與MCAO組小鼠相比,RTG組小鼠的Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)升高。
結(jié)論:
1本實(shí)驗(yàn)通過線栓法成功建立小鼠永久性右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模
23、型,發(fā)現(xiàn)模型建立后1小時(shí)腹腔注射瑞替加濱5mg/kg、10mg/kg可以顯著降低小鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦梗死體積,且以該劑量于局灶性腦缺血發(fā)生后0-3小時(shí)給藥均能發(fā)揮腦保護(hù)作用,為進(jìn)一步研究瑞替加濱腦保護(hù)作用的治療時(shí)間窗提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
2瑞替加濱干預(yù)可以降低實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦組織切片的 TUNEL陽性細(xì)胞數(shù),抑制腦細(xì)胞核 DNA的斷裂;還可以降低實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠 cleaved caspase-3蛋白的表達(dá),抑制 casp
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