氧化還原對心肌L型鈣通道的調(diào)節(jié)作用及作用機制.pdf

1、目的：
　　鈣離子通道是廣泛存在于機體各種組織細胞膜上離子通道，尤其是骨骼肌和心肌，其能夠參與細胞中諸多重要的生命活動。L型鈣通道(L-type calcium channel，LTCC)是存在于心肌細胞的主要類型，是鈣離子進入心肌細胞的主要途徑，在動作電位的形成、興奮收縮偶聯(lián)和基因表達等方面都發(fā)揮重要作用，也是細胞內(nèi)鈣釋放的重要觸發(fā)因素，鈣離子通過LTCC內(nèi)流，激活鈣離子從肌漿網(wǎng)中釋放，對心肌的興奮—收縮偶聯(lián)過程發(fā)揮著重要作用。

2、
　　氧化還原狀態(tài)的失衡已經(jīng)被證實與許多疾病相關(guān)。高水平的氧化應(yīng)激主要產(chǎn)物為活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS能夠通過修飾蛋白，脂質(zhì)體和基因等來發(fā)揮其細胞毒性。研究表明，氧化還原狀態(tài)的失衡在高血壓、心衰、動脈粥樣硬化、糖尿病和心肌肥大等疾病中起到重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)氧化還原作用還可參與調(diào)節(jié)離子通道和轉(zhuǎn)運體的功能，進而在某些生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　Cav1.2鈣通道能夠直接或間

3、接的被氧化還原作用所調(diào)節(jié)。二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）是一個膜可滲透性還原試劑，參與心肌細胞鈣離子通道的調(diào)節(jié)，調(diào)控的結(jié)果仍然存在爭議。有大量研究表明，氧化劑H2O2也能夠?qū)π募〖毎械拟}離子通道進行調(diào)節(jié)。氧化應(yīng)激對Cav1.2通道的調(diào)節(jié)十分復雜并且仍存在爭議。硫氧還蛋白系統(tǒng)是存在于哺乳細胞體內(nèi)的氧化還原敏感的多功能小分子蛋白系統(tǒng)。硫氧還蛋白系統(tǒng)能夠清除體內(nèi)的過氧化物，使細胞免受氧化應(yīng)激的損傷。GSH可清除體內(nèi)的氧自

4、由基、脂質(zhì)過氧化物，GSH本身則變?yōu)镚SSG，而GSSG也可以在酶的作用下還原為GSH。正常生理狀態(tài)下，GSH和GSSG處于動態(tài)平衡狀態(tài)。當生物體經(jīng)受氧化應(yīng)激時，GSSG不能再還原成GSH，導致GSSG在細胞內(nèi)的堆積，導致細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)的失衡。
　　膜片鉗技術(shù)被認為研究離子通道的“金標準”，是研究離子通道的一項最重要技術(shù)。膜片鉗有多種記錄模式，包括細胞吸附模式、膜內(nèi)面向外模式、膜外面向內(nèi)模式、常規(guī)全細胞模式和穿孔膜片模式等。

5、膜片鉗實驗過程中，在形成膜內(nèi)面向外記錄模式之后，會隨著時間記錄時間的延長而出現(xiàn)電流逐漸衰減的現(xiàn)象，我們稱之為run-down現(xiàn)象。為了使在形成膜內(nèi)面向外模式后電流不出現(xiàn)衰減現(xiàn)象，我們采用了CaM和ATP，以維持電流的持續(xù)，以便后續(xù)研究。
　　CaM是一種廣泛的鈣離子結(jié)合蛋白，直接或間接地參與酶的調(diào)節(jié)、肌肉的收縮、基因表達等多種重要的生命過程。亦能通過直接與通道的相互作用而對心肌細胞Cav1.2鈣通道有著重要的調(diào)節(jié)作用CaM可以與心

6、肌細胞Cav1.2鈣離子通道多個部位結(jié)合，包含α1亞單位的N末端(NSCaTE序列)、C末端（pre-IQ序列、IQ序列等）、連接α1亞單位序列Ⅰ～序列Ⅱ的多肽鏈等，從而對心肌細胞膜上Cav1.2鈣離子通道的功能活性進行調(diào)控。
　　本研究將采用膜片鉗該實驗技術(shù)分別在cell-attached和inside-out模式下，檢測Cav1.2通道活性的變化，以探討氧化還原狀態(tài)對心肌細胞Cav1.2通道的影響。再應(yīng)用pull-down實驗

7、技術(shù)來探討氧化還原作用對心肌L型鈣通道的作用是否是通過改變通道蛋白自身與CaM的結(jié)合而實現(xiàn)的。
　　實驗材料和方法：
　　一、材料
　　雌性健康豚鼠，體重350-550g，由日本鹿兒島大學實驗動物中心提供。Tryptone，Yeast extract（英國Oxoid公司）;Aspartic acid，Glutamic acid（美國Amresco公司）:ProteaseⅣ，DeoxyribonucleaseⅠ，H2O2

8、（美國Sigma公司）;Collagenase（日本Yakult公司）;PreScission Protease，Glutathione-Sepharose4B beads，DTT，GST inclusion body solubilization and renaturaton kit（美國GE Healthcare公司）;APS,BSA，NaCl、KCl、MgCl2、CaC12、BaCl2、NaH2PO4、NaOH、KOH、CsOH

9、、KH2PO4、HCl、Glucose、Tris（日本W(wǎng)ako公司）。
　　二、方法
　?。ㄒ唬╇嗍笮募〖毎姆蛛x
　　利用Langendorff灌流裝置，采用膠原酶消化豚鼠心室肌細胞，得到單個心肌細胞。
　?。ǘ﹩瓮ǖ棱}電流的記錄
　　采用膜片鉗技術(shù)細胞貼附和膜內(nèi)向外模式記錄豚鼠心室肌細胞膜上鈣通道單通道電流。用pClamp10.0軟件記錄數(shù)據(jù)，用Kameyama計算軟件分析通道的平均開放概率。

10、　?。ㄈ┾}通道蛋白片段的表達和純化
　　采用GST包涵體變性復性試劑盒提取純化GST-CT1蛋白，液氮反復凍融的方法，制備蛋白。應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)和考馬斯亮藍法鑒定其純化程度和濃度。
　　結(jié)果：
　　1、采用GST變性復性試劑盒提取純化出的GST-CT1蛋白及CaM蛋白具有較高的純度及濃度，提取出的蛋白濃度均能大于1mg/mL，并且GST-CT1能夠濃度依賴性的與CaM蛋白結(jié)合。
　　2、在cell-a

11、ttached模式下，1mM DTT能夠顯著降低Cav1.2通道活性至72±6％(n=35，P＜0.01)，而1mM H2O2能夠顯著升高Cav1.2通道活性至303±39％(n=23，P＜0.01)。而DTT和H2O2預處理并不能影響單通道電流幅度(unitarycurrent amplitude):處理前電流幅度為:1.10±0.03pA; DTT處理后電流幅度為:1.03±0.02pA; H2O2處理后電流幅度為:1.17±0.0

12、5pA，n=6，P＞0.05。
　　3、在inside-out模式下，CaM+ ATP介導的通道活性是cell-attached模式下的187±26％(n=9，對照)，同樣在CaM+ATP存在下，1mM DTT能夠降低通道活性至123±6％(n=6，P＜0.05)，而1mM H2O2能夠升高通道活性至303±19％(n=6，P＜0.05)。
　　4、采用生物體內(nèi)存在還原系統(tǒng)(100mM硫氧還蛋白(Trx)+20nM硫氧還蛋白

13、還原酶(TrxR)+0.3mM NADPH)通道活性可以降低至138±8％(n=4)(vs.對照179±29％(n=4))，而氧化系統(tǒng)(3mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)+0.3mM還原型谷胱甘肽(GSH))可使通道活性升高至263％±49％(n=4)(vs.對照179±29％(n=4))。并且氧化系統(tǒng)能夠逆轉(zhuǎn)還原系統(tǒng)對通道活性的作用。
　　5、給予1mM DTT或1 mMH2O2預處理GST-NT蛋白，并不能改變其與CaM結(jié)合(D

14、TT:0.27±0.01a.u.vs.control:0.25±0.01a.u.，n=5，P＞0.05; H2O20.26±0.01a.u.vs.control:0.25±0.01a.u.，n=5，P＞0.05);而1mM DTT預處理GST-CT1蛋白能夠顯著降低其與CaM結(jié)合(DTT:0.40±0.02a.u.vs.control:0.57±0.03a.u.，n=5，P＜0.05)，1mMH2O2預處理GST-CT1蛋白卻無法改變其

15、與CaM結(jié)合(H2O2:0.54±0.03a.u.vs.control:0.57±0.03a.u.，n=5,P＞0.05)。
　　6、給予10-7-10-2M DTT預處理GST-CT1蛋白，能夠濃度依賴性的降低與CaM的結(jié)合(control:0.54±0.03a.u.vs.10mM DTT:0.30±0.03a.u.，n=10，P＜0.05),10mM DTT導致CaM與GST-CT1結(jié)合降低了44.4％，并且IC50為37μM

16、。
　　結(jié)論：
　　1、采用GST變性復性試劑盒提取純化的GST-CT1蛋白和液氮反復凍融方法制備的GST-NT蛋白、CaM蛋白具有良好的純度和濃度，并具有一定的生物學活性。
　　2、在cell-attached模式下，DTT降低通道活性，而H2O2升高通道活性，說明氧化還原狀態(tài)能夠調(diào)控鈣通道的活性，并且還原和氧化狀態(tài)對鈣通道活性的調(diào)節(jié)作用是相反的。
　　3、在inside-out模式下，DTT降低通道活性，而H

17、2O2升高通道活性，表明還原和氧化狀態(tài)不是通過作用于細胞內(nèi)因子如CaM、ATP等，而可能是通過與Cav1.2通道的直接作用而實現(xiàn)的。
　　4、在inside-out模式下，谷胱甘肽和NADPH的氧化還原系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)通道活性:還原系統(tǒng)能夠降低通道活性，而氧化系統(tǒng)能升高通道活性，并且氧化能夠逆轉(zhuǎn)還原系統(tǒng)對通道活性的作用。
　　5、DTT能夠濃度依賴性的降低與CaM蛋白的結(jié)合，但H2O2卻無法改變GST-CT1與CaM蛋白的結(jié)合。