Sigma-1受體對(duì)N型鈣通道的負(fù)性調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、Sigma受體是具有伴侶蛋白活性的一類(lèi)受體蛋白。鑒于其與其他哺乳動(dòng)物蛋白沒(méi)有同源性以及與其他受體相比所具有的獨(dú)特的生理功能，現(xiàn)在也被認(rèn)為是一類(lèi)孤兒受體。目前認(rèn)為Sigma受體家族包括兩個(gè)亞型，一個(gè)亞型為Sigma-1受體，另一個(gè)亞型為Sigma-2受體。由于到現(xiàn)在為止，還未獲得Sigma-2受體的克隆，也不清楚其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)，所以對(duì)它的研究比較少也比較滯后，研究重點(diǎn)一般集中在Sigma-1受體。Sigma-1受體主要聚集于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

2、，并廣泛分布在MAM膜、細(xì)胞膜以及核膜等細(xì)胞膜系統(tǒng)上。經(jīng)過(guò)研究人員對(duì)該受體將近40年的研究，尤其在獲得Sigma-1受體的克隆及Sigma-1受體敲除鼠后，我們對(duì)其在結(jié)構(gòu)和功能上的認(rèn)識(shí)越來(lái)越清晰。Sigma-1受體是包含223個(gè)氨基酸的一條蛋白質(zhì)單鏈，其分子量大小約為26 kDa。之前大多數(shù)研究認(rèn)為Sigma-1受體包括兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，且N端和C端均位于膜內(nèi)側(cè)。而在2016年，對(duì)人源Sigma-1受體的晶體結(jié)構(gòu)解析結(jié)果表明，Sigma-

3、1受體是以寡聚體(一般是三聚體)形式存在的一類(lèi)單次跨膜蛋白，其 N端在膜外，C端則位于膜內(nèi)側(cè)。在其功能方面，Sigma-1受體在體內(nèi)發(fā)揮著眾多的生理功能，參與許多疾病的調(diào)控，如記憶損傷、癌癥、心臟疾病、中風(fēng)、抑郁、阿爾茲海默癥、精神分裂等疾病。Sigma-1受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)最豐富，其功能也最為復(fù)雜。通過(guò)電生理學(xué)及行為藥理學(xué)研究表明該受體參與包括抑郁、焦慮、精神分裂、學(xué)習(xí)記憶、成癮以及疼痛在內(nèi)的中樞疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。對(duì)以上疾病或

4、病理過(guò)程進(jìn)行成因分析，發(fā)現(xiàn)這些疾病的形成和發(fā)展均與相應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和傳導(dǎo)緊密相關(guān)。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，Sigma-1受體對(duì)多巴胺能、谷氨酸能、5-羥色胺能、腎上腺素能、γ-氨基丁酸能和膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和傳導(dǎo)都可產(chǎn)生或增強(qiáng)或抑制的調(diào)節(jié)作用，但是產(chǎn)生該調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制目前并未被完全闡明。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果，N型鈣離子通道的開(kāi)放可引起神經(jīng)遞質(zhì)的釋放并可直接調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞和突觸的輸出，在控制中樞內(nèi)大部分神經(jīng)遞質(zhì)釋放和傳導(dǎo)的過(guò)程中均有重

5、要作用。根據(jù)目前的研究進(jìn)展，我們得知Sigma-1受體可以與許多電壓依賴或配體依賴的離子通道(包括鉀離子通道、鈉離子通道和酸敏感型離子通道等)發(fā)生相互作用，通過(guò)影響離子通道的電生理特性進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的生理效應(yīng)。所以，我們推測(cè)Sigma-1受體是否通過(guò)調(diào)節(jié) N型鈣通道進(jìn)而影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和傳導(dǎo)。但是，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)關(guān)于Sigma-1受體與N型鈣通道之間的關(guān)系，目前還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。即，目前為止我們還并不清楚Sigma-1受體能否通過(guò)

6、影響N型鈣通道的開(kāi)放或關(guān)閉而影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。
　　為探索Sigma-1受體對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放的影響，我們選擇 N型鈣通道作為我們研究的切入點(diǎn),故本實(shí)驗(yàn)旨在探討Sigma-1受體對(duì)N型鈣通道的調(diào)節(jié)作用。結(jié)合大膽堿能神經(jīng)元(ChIs)是唯一可以合成并釋放乙酰膽堿的神經(jīng)元，本研究首次利用scRT-PCR以及免疫熒光的方法證明了Sigma-1受體在ChIs上有表達(dá)，并通過(guò)scRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ChIs上主要表達(dá)N型鈣離子通道，表明C

7、hIs可以作為我們理想的研究模型。利用腦片膜片鉗方法發(fā)現(xiàn)Sigma-1受體對(duì)ChIs上的鈣通道存在抑制作用。為了進(jìn)一步研究Sigma-1受體單獨(dú)對(duì) N型鈣通道的作用，選用對(duì)研究離子通道具有明顯優(yōu)勢(shì)的爪蟾卵母細(xì)胞作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)Sigma-1受體可以同時(shí)以配體依賴以及配體非依賴的方式對(duì)N型鈣通道產(chǎn)生抑制作用。運(yùn)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀(CO-IP)實(shí)驗(yàn)得知，Sigma-1受體與N型鈣通道之間存在直接相互作用，在 H

8、EK-293T細(xì)胞中可以形成蛋白復(fù)合體。
　　綜上，本文利用腦片膜片鉗方法、雙電極電壓鉗技術(shù)以及分子生物學(xué)研究方法，闡明了 Sigma-1受體對(duì)N型鈣通道的作用以及作用方式，并為進(jìn)一步研究Sigma-1受體、N型鈣通道以及神經(jīng)遞質(zhì)三者之間的關(guān)系提供了相應(yīng)的研究基礎(chǔ)和線索。具體結(jié)果如下：
　　1、根據(jù)已有文獻(xiàn)，紋狀體的大膽堿能神經(jīng)元(Cholinergic Interneurons,ChIs)上主要表達(dá)三種類(lèi)型的鈣離子通道，即

9、：N型鈣離子通道、P/Q型鈣離子通道和L型鈣離子通道。其中N型鈣離子通道的表達(dá)豐度最高。為了驗(yàn)證這一結(jié)論，我們采用單細(xì)胞 RT-PCR技術(shù)(single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,scRT-PCR)方法在38個(gè)ChIs上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在轉(zhuǎn)錄水平，92.1％的神經(jīng)元上有N型鈣通道的轉(zhuǎn)錄，78.9%的神經(jīng)元上有P/Q型鈣通道的轉(zhuǎn)錄，28.9%的神經(jīng)元上有L型

10、鈣通道的轉(zhuǎn)錄。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示我們可以選用ChIs作為我們的研究對(duì)象。
　　2、結(jié)合ChIs在調(diào)控乙酰膽堿的釋放中的作用，我們選擇ChIs作為研究對(duì)象。首先需要驗(yàn)證Sigma-1受體在ChIs上是否有表達(dá)。通過(guò)在30個(gè)ChIs上進(jìn)行scRT-PCR,Sigma-1受體在ChIs上均有轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步通過(guò)連續(xù)切片免疫熒光實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在蛋白水平上Sigma-1受體在ChIs上也有表達(dá)。通過(guò)scRT-PCR以及免疫熒光的方法，我

11、們首次證明Sigma-1受體在ChIs上有表達(dá)，這也成為我們研究Sigma-1受體在ChIs上對(duì)N型鈣通道作用的基礎(chǔ)。
　　3、運(yùn)用電生理方法，在腦片背側(cè)紋狀體的ChIs上，我們記錄到鈣離子電流。向記錄液中加入500 nM的N型鈣通道特異性阻斷劑ω--芋螺毒素-GVIA，鈣離子電流被抑制到原電流幅度的27.7%±16.0%，表明N型鈣電流在所記錄的鈣電流中占比達(dá)72.3%(n=3, P<0.05）。為觀察Sigma-1受體是否對(duì)N

12、型鈣通道有調(diào)節(jié)作用。我們選用 Sigma-1受體的選擇性激動(dòng)劑 SKF-10047，將不同濃度的該激動(dòng)劑加入到正常記錄外液中，得到其對(duì)鈣電流相應(yīng)的抑制作用。50μM的SKF-10047抑制鈣電流至原電流的61.3%±7.1%(n=11,P<0.05)，25μM和12.5μM的SKF-10047分別抑制鈣電流幅度為原電流的71.6%±4.9%(n=9,P<0.05)和106.9%±18.2%(n=4,P>0.05)。此外，為進(jìn)一步驗(yàn)證Si

13、gma-1受體激動(dòng)劑的抑制作用，我們選用另外一種激動(dòng)劑Pre-084,50μM Pre-084可以抑制ChIs的鈣電流至原電流幅度的72.9%±6.4%(n=7, P<0.05)。由此可知，Sigma-1受體激動(dòng)劑對(duì)ChIs上的鈣電流有抑制作用。為證實(shí)該抑制作用是通過(guò)Sigma-1受體介導(dǎo)的，我們給以Sigma-1受體拮抗劑BD-1063100μM,與50μM SKF-10047聯(lián)合使用加入至記錄液后發(fā)現(xiàn)，鈣電流幅度為原電流的90.0%

14、±5.1%（n=5,P>0.05）。結(jié)果表明，Sigma-1受體激動(dòng)劑對(duì)ChIs鈣電流的抑制作用是通過(guò)Sigma-1受體介導(dǎo)的，而這些鈣電流中包括N-型鈣電流。
　　4、鑒于爪蟾卵母細(xì)胞在研究離子通道上的優(yōu)勢(shì)，為方便進(jìn)一步研究 Sigma-1受體對(duì)N型鈣通道的作用，我們選用爪蟾卵母細(xì)胞為研究模型。將該受體和離子通道的cRNA首先分別注入卵母細(xì)胞作為對(duì)照組。通過(guò)雙電極電壓鉗記錄得到N型鈣電流，并運(yùn)用Western Blot得到Sig

15、ma-1受體的蛋白表達(dá)，以上結(jié)果可以說(shuō)明獨(dú)立表達(dá)Sigma-1受體和N型鈣通道的卵母細(xì)胞表達(dá)模型建立成功。
　　5、為研究二者之間的相互作用，需建立同時(shí)表達(dá)Sigma-1受體和N型鈣通道的表達(dá)體系。將兩者的cRNA以體積比1:1混合均勻后注入卵母細(xì)胞，48 h后開(kāi)始記錄，結(jié)果顯示，未能記錄到正常的N型鈣電流。通過(guò)逐漸降低Sigma-1受體的體積比，保持N型鈣通道的體積不變，在Sigma-1受體與N型鈣通道的體積比為0.5:1、0.

16、25:1、0.125:1、0.0625:1、0.03125:1比例條件下，記錄到的N型鈣電流幅度分別為單獨(dú)表達(dá)的N型鈣通道的電流幅度的29.9%±3.9%(n=18,P<0.001),52.6%±3.8%(n=17,P<0.001),72.1%±3.7%(n=26,P<0.001),85.0%±5.8%(n=17,P<0.05),89.9%±7.5%(n=10,P>0.05)。由此得出結(jié)論，N型鈣電流的幅度隨著Sigma-1受體表達(dá)的減

17、少而增大，并且這種作用是配體非依賴性的。
　　6、為了觀察Sigma-1受體對(duì)N型鈣通道在同時(shí)表達(dá)二者的卵母細(xì)胞中是否存在配體依賴型作用，我們選擇體積比為Sigma-1受體: N型鈣通道=0.25:1的卵母細(xì)胞作為研究對(duì)象。在此條件下，既有Sigma-1受體的表達(dá)，也可同時(shí)記錄到N型鈣電流。通過(guò)電生理方法，分別給以卵母細(xì)胞1μM、5μM、25μM、50μM、100μM的SKF-10047，得到其鈣電流分別被抑制至原電流的94.9%

18、±1.6%(n=8,P<0.05),89.9%±1.1%(n=20,P<0.005),83.0%±0.7%(n=10,P<0.001),73.5%±6.5%(n=7,P<0.001),67.7%±3.7%(n=5,P<0.001)。發(fā)現(xiàn)SKF-10047在該條件下均對(duì)N型鈣通道有抑制作用。為驗(yàn)證該抑制作用是由Sigma-1受體介導(dǎo)的，向其記錄液中加入Sigma-1受體拮抗劑50μM BD-1063,其對(duì)N型鈣通道則無(wú)明顯抑制作用（抑制至

19、原電流幅度的93.2%±2.1%, n=6,P>0.05）。同時(shí)將50μM SKF-10047與50μM BD-1063加入記錄液中，發(fā)現(xiàn)BD-1063可以阻斷SKF-10047對(duì)N型鈣通道的抑制作用（此時(shí)記錄到的電流為原電流的87.2%±2.2%, n=6,P>0.05）。由此可知，SKF-10047對(duì)N型鈣通道的抑制作用是由Sigma-1受體介導(dǎo)的。該結(jié)果與在ChIs上得到的結(jié)果是一致的。
　　7、為研究胞內(nèi)鈣釋放通道對(duì)N型鈣

20、電流是否有影響，向電極內(nèi)液中加入胞內(nèi)鈣釋放通道的特異性阻斷劑進(jìn)行胞內(nèi)給藥。將胞內(nèi)鈣螯合劑20 mM BAPTA、IP3受體特異阻斷劑100μM2-APB、Ryanodine受體特異性阻斷劑10μM釕紅分別加入電極內(nèi)液，首先記錄N型鈣電流作為組內(nèi)對(duì)照組，然后向記錄液中加入100μM SKF-10047，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞在受到Sigma-1受體激動(dòng)劑刺激之前與之后的N型鈣電流的差異。結(jié)果顯示：100μM SKF-10047在BAPTA、釕紅和2-A

21、PB存在時(shí)對(duì)N型鈣電流的抑制作用分別為抑制至原電流的：83.4%±2.3%(n=6,P<0.05)、86.9%±1.1%(n=7,P<0.05)、93.9%±1.1%(n=5,P<0.05)，單獨(dú)100μM SKF-10047的作用為67.7%±3.7%(n=5,P<0.05)。
　　8、由以上結(jié)果，我們提出假設(shè)：Sigma-1受體與N型鈣通道在細(xì)胞內(nèi)可能存在直接的蛋白相互作用或是二者之間的距離非常接近。為便于直觀地觀察到質(zhì)粒的表

22、達(dá)，我們選用HEK-293T細(xì)胞作為表達(dá)體系。利用熒光共聚焦顯微鏡，觀察到Sigma-1受體(紅色)與N型鈣通道(綠色)均可正常表達(dá)。在同時(shí)轉(zhuǎn)染兩種蛋白的細(xì)胞內(nèi)，黃色熒光結(jié)果顯示Sigma-1受體與N型鈣通道可同時(shí)正常表達(dá)，并可能存在共定位。
　　9、為確證Sigma-1受體與N型鈣通道之間是否存在共定位，我們采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)初步驗(yàn)證

23、這一猜想。符合熒光面積大于0.02m2，熒光強(qiáng)度大于或等于0.5條件的信號(hào)點(diǎn)可以認(rèn)為存在蛋白-蛋白相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在共同轉(zhuǎn)染Sigma-1受體與N型鈣通道的細(xì)胞內(nèi)，11個(gè)觀察視野下，共有203個(gè)符合條件的信號(hào)點(diǎn)。而在陰性對(duì)照組中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)符合條件的信號(hào)。初步得出結(jié)論：Sigma-1受體與N型鈣通道在HEK-293T細(xì)胞中可以形成蛋白-蛋白直接相互作用。
　　10、利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證受體-離子通道蛋白復(fù)合體的存在。

24、結(jié)果顯示，Sigma-1受體的抗體或N型鈣通道的抗體可以將Sigma-1受體與N型鈣通道一并通過(guò)免疫作用沉淀下來(lái)。在陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)組中，未能觀察到相應(yīng)的或特異性的免疫印跡條帶。這表明二者之間確實(shí)存在蛋白質(zhì)之間的相互作用。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可知本研究首次在大鼠背側(cè)紋狀體的ChIs中發(fā)現(xiàn)
　　Sigma-1受體的表達(dá)。并且利用電生理學(xué)技術(shù)在大鼠腦片組織中的ChIs以及外源爪蟾卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，Sigma-1受體可以配體依賴性地抑制N型

25、鈣電流。在爪蟾卵母細(xì)胞中，外源性表達(dá)的Sigma-1受體可以同時(shí)以配體非依賴性的方式抑制N型鈣電流，并且該抑制作用與Sigma-1受體的蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)的趨勢(shì)。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明外源性的Sigma-1受體與N型鈣通道可以在HEK-293T細(xì)胞中形成蛋白復(fù)合體。由此可知，Sigma-1受體對(duì)N型鈣通道的負(fù)性調(diào)節(jié)作用可能是通過(guò)蛋白-蛋白相互作用以及激動(dòng)劑誘導(dǎo)的受體變構(gòu)調(diào)節(jié)作用引起的。據(jù)此，我們推測(cè)Sigma-1受體可以通過(guò)調(diào)節(jié)N型鈣通道的