TLR4-NF-κB通路在CD38基因缺失引起的B淋巴細(xì)胞發(fā)育障礙中的作用.pdf

1、目的:
　　脾臟是機(jī)體中重要的外周免疫器官，是觸發(fā)免疫應(yīng)答的場(chǎng)所。其中集聚的免疫細(xì)胞主要是淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，B淋巴細(xì)胞占脾淋巴細(xì)胞總數(shù)的60％左右，是機(jī)體內(nèi)唯一可以產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，同時(shí)又作為抗原提呈細(xì)胞，參與體液免疫及細(xì)胞免疫并發(fā)揮重要作用。B淋巴細(xì)胞的發(fā)育成熟經(jīng)歷了多步驟、復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控過程，其發(fā)育障礙可引起自身免疫性疾病、腫瘤等。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)生理狀態(tài)下，CD38基因缺失小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞發(fā)育障礙，LPS刺激后，CD3

2、8基因缺失小鼠中脾臟B淋巴細(xì)胞發(fā)育障礙更為顯著;TLR4mut小鼠骨髓B細(xì)胞發(fā)育障礙;這些結(jié)果提示，CD38和TLR4可能在B淋巴細(xì)胞發(fā)育障礙中起重要作用。本文旨在研究:1.CD38基因缺失引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞發(fā)育障礙的原因2.生理狀態(tài)下，TLR4在CD38基因缺失引起的B淋巴細(xì)胞發(fā)育障礙中的作用及關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。通過這些探索將會(huì)為B淋巴細(xì)胞發(fā)育障礙影響因素的研究提供新的理論依據(jù)，有助于為臨床B淋巴細(xì)胞發(fā)育障礙性疾病的治療提供新的思路。
　　

3、方法:
　　1.取6周齡雌性WT（野生型C57BL/6）小鼠，利用免疫磁珠法(MACS)分離純化小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞表面抗體(CD45RPerCP-Cyanine5.5，CD3e FITC)染色，通過流式細(xì)胞熒光分選法(FACS)鑒定B淋巴細(xì)胞分離純化后純度。
　　2.分離純化小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real time PCR)檢測(cè)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞中CD38和TLR4的m

4、RNA表達(dá)水平。
　　3.無菌取小鼠脾臟得到脾臟細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，進(jìn)一步分離純化小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞并計(jì)數(shù)，比較WT、CD38-/-C3H/HeN和CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾臟總細(xì)胞數(shù)和B淋巴細(xì)胞數(shù)量的差異。
　　4.對(duì)分離純化后的小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞進(jìn)行表面相應(yīng)抗體的染色，利用流式細(xì)胞技術(shù)（Flow Cytometry,FCM）對(duì)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的成熟、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)。
　　5.對(duì)分離純化后的小鼠脾臟

5、B淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外LPS刺激培養(yǎng)，通過CellCounting Kit-8法檢測(cè)WT、CD38-/-C3H/HeN和CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞增殖情況。
　　6.通過蛋白免疫印記法(Western blotting)檢測(cè)WT、CD38-/-C3H/HeN和CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞中TLR4、Bcl-2、caspase-8、NF-κB1、Phospho-NF-κB1、P65、Phosp

6、ho-p65、Sirt1的蛋白表達(dá)水平。
　　7.通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real time PCR)檢測(cè)WT、CD38-/-C3H/HeN和CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-4、BAFF、BAFFR、RelB的mRNA表達(dá)水平。
　　8.通過酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)定WT,CD38-/-C3H/HeN和

7、CD38-/-C3H/HeJ小鼠血清中TNF-α、IL-1β的蛋白表達(dá)水平。
　　9.通過對(duì)WT,CD38-/-C3H/HeN和CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾臟進(jìn)行蘇木素-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色）觀察脾臟的組織學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1.通過MACS分離提純小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞，經(jīng)FACS鑒定CD3e-CD45R+細(xì)胞純度達(dá)到96.8％，符合實(shí)驗(yàn)純度要求。
　

8、　2.同WT小鼠比較，CD38-/-C3H/HeN小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞中，CD38基因表達(dá)明顯下降，TLR4基因表達(dá)明顯升高;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞中，CD38基因表達(dá)無明顯差異，TLR4表達(dá)明顯下降。
　　3.同WT小鼠比較，CD38-/-C3H/HeN小鼠脾臟總細(xì)胞數(shù)和脾臟B淋巴細(xì)胞數(shù)均顯著下降;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾

9、臟總細(xì)胞數(shù)和B淋巴細(xì)胞數(shù)均無明顯差異。
　　4.同WT小鼠比較，CD38-/-C3H/HeN小鼠脾臟T1-T2B細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)型障礙（T1B細(xì)胞亞群比例從17.5％升為28.9％）有顯著性差異，Mature B細(xì)胞顯著減少;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾臟T1-T2B細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)型障礙略有增加（T1B細(xì)胞亞群比例從28.9％升為33.1％），但無明顯差異;Mature B細(xì)胞略減少，無明顯差異。

10、
　　5.同WT小鼠比較，CD38-/-C3H/HeN小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖無明顯變化;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖顯著減少。
　　6.同WT小鼠比較，CD38-/-C3H/HeN小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞凋亡顯著增加;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞凋亡顯著下降。
　　7.同WT小鼠比較，CD38-/-C3H/He

11、N小鼠S期細(xì)胞百分比增加（平均百分比從1.32％到1.89％）;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，CD38-/-C3H/HeJ小鼠S期百分比下降（平均百分比從1.89％到1.03％）。均具有顯著性差異。
　　8.同WT小鼠比較，CD38-/-C3H/HeN小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞中TLR4、Phospho-NF-κB1/NF-κB1、Phospho-p65/p65、Sirt1蛋白表達(dá)顯著升高;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，T

12、LR4、Phospho-NF-κB1/NF-κB1、Phospho-p65/p65、Sirt1蛋白表達(dá)顯著下降。Bcl-2、caspase-8無明顯差別。
　　9.同WT小鼠比較，CD38-/-C3H/HeN小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-4、BAFF、BAFFR、RelB的mRNA水平表達(dá)顯著下降;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，BAFFR、TNF-α、IL-1β的mRNA水平表達(dá)顯著上升，而RelB、B

13、AFF、IL-4沒有明顯變化。
　　10.同WT小鼠比較，CD38-/-C3H/HeN小鼠血清中TNF-α、IL-1β的蛋白表達(dá)水平顯著下降;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，CD38-/-C3H/HeJ小鼠血清中TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平無明顯差異。
　　11.同WT小鼠比較，CD38-/-C3H/HeN小鼠脾臟中炎性細(xì)胞數(shù)目減少;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾臟中炎性

14、細(xì)胞數(shù)目增多。
　　結(jié)論:
　　1.小鼠基因型穩(wěn)定并且通過磁珠陰選法分離提純小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的純度符合實(shí)驗(yàn)要求，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
　　2.生理狀態(tài)下，CD38基因缺失小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞發(fā)育障礙主要原因是成熟障礙、凋亡增加和周期阻滯，但細(xì)胞增殖無顯著差異。TLR4在CD38基因缺失引起的小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞凋亡增加和周期阻滯中起重要作用。
　　3.CD38基因缺失可激活TLR4/NF-κB通路，但NF-κB