BLM解旋酶的酶學(xué)特性與DHBN結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、以大腸桿菌recQ基因命名的RecQ家族解旋酶是對基因組穩(wěn)定性維持極為重要的分子馬達蛋白，其功能幾乎涉及到DNA復(fù)制、修復(fù)、重組、轉(zhuǎn)錄和端粒維持等代謝過程。在人類的五種RECQ解旋酶中，基因blm，wrn和recq4的突變分別會引起三種顯著不同的疾病病征:布魯姆綜合征(Bloom syndrome，BS)、沃納綜合征(Wemer syndrome，WS)和先天性血管萎縮皮膚異色綜合征（Rothmund Thomson syndrome，

2、RTS）。其中，BS病人細胞最典型的特點是呈現(xiàn)出比正常人約高10倍的姐妹染色單體交換率(Sisterchromatid exchanges，SCEs)，而且傾向于形成多種惡性腫瘤。由于所有已鑒定的RecQ家族解旋酶都具有結(jié)構(gòu)和功能特點非常相似的C端解旋酶核心結(jié)構(gòu)域，所以，N端的顯著差異可能是細胞中各解旋酶具有特異功能的重要因素。然而，截至目前，關(guān)于BLMN端結(jié)構(gòu)研究的報導(dǎo)仍較欠缺，關(guān)于BLM全長蛋白結(jié)構(gòu)的研究也因其穩(wěn)定性低、回收量少、大

3、量純化耗資多等而受到限制。
　　首先，鑒于以上不足，本研究在與已報導(dǎo)的BLM同源蛋白的序列和表達系統(tǒng)進行對比分析的基礎(chǔ)上，選取與人BLM解旋酶（homo sapiens BLM helicase，簡稱hBLM）親緣關(guān)系較近的模式生物雞BLM解旋酶(Gallus gallus BLM helicase，簡稱gBLM)為研究對象，優(yōu)化并確立了gBLM及其截短蛋白gBLM Core和gBLM CΔHRDC在大腸桿菌中的高水平表達和高產(chǎn)量

4、純化方法體系，這可為gBLM酶學(xué)特性和生物物理實驗研究提供足量高質(zhì)量的蛋白。通過對gBLM進行凝膠過濾層析、動態(tài)光散射(DLS)、熒光各向異性DNA結(jié)合實驗、快速停留DNA解旋實驗的酶學(xué)特性測定，研究得出以下結(jié)論:(1) gBLM是一種活力較強的非典型性DNA結(jié)構(gòu)特異性解旋酶，不僅對具有3'尾鏈的DNA結(jié)構(gòu)底物具有高親和性，而且可有效結(jié)合并解旋具有平末端結(jié)構(gòu)的復(fù)制泡狀DNA底物，這暗示了gBLM潛在的加工DNA代謝中間物的生物學(xué)功能。(

5、2)不同截短gBLM蛋白的活性對比分析顯示gBLM N端不僅與gBLM的多聚體形成相關(guān)，而且具有明顯的輔助結(jié)合復(fù)制叉和復(fù)制泡狀DNA底物的功能，對多種DNA結(jié)構(gòu)底物的解旋也是必需的，這揭示了N端對BLM聚體和活性的調(diào)控作用。(3) DNA結(jié)合和解旋活性對比分析也顯示HRDC結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)出明顯的輔助gBLM結(jié)合和解旋大多數(shù)復(fù)雜結(jié)構(gòu)DNA底物的特性。因此，gBLM的大量高純度純化策略及相應(yīng)的酶學(xué)特性分析結(jié)果可為hBLM的結(jié)構(gòu)和分子機理研究提供

6、一個新的參考模型。
　　其次，基于以上gBLM的酶學(xué)特性分析，本研究進一步綜合利用生物信息學(xué)、生物化學(xué)和生物物理學(xué)方法對BLM的N端進行了深入研究，并取得了以下結(jié)果:
　　(1)對數(shù)據(jù)庫中已測序的78種BLM同源蛋白的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):BLM同源蛋白N端在物種間差異較大，序列保守性低，且柔性區(qū)域較多，推測BLM同源蛋白N端可能不具有保守的三維結(jié)構(gòu)。然而，進一步的分析發(fā)現(xiàn)其中含2至3個二級結(jié)構(gòu)元件的DHBN（Dimeriza

7、tion Helical Bundle in N-terminal domain，N端二聚化螺旋束）是存在于脊椎動物BLM同源蛋白N端中的唯一高度保守的結(jié)構(gòu)域，這可能與其在進化中的重要生物功能相關(guān)。gDHBN結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高的特點在不同截短gBLM N端蛋白的限制性蛋白水解實驗和LC-MS/MS鑒定中也得到了驗證。
　　(2)通過對不同BLM N端截短蛋白的系統(tǒng)晶體初篩、優(yōu)化、X-射線晶體衍射與解析，研究分別獲得了hBLM、gBLM和

8、pBLM(Pelecanus crispus BLM helicase) DHBN的高分辨率的晶體結(jié)構(gòu):hDHBN(2.0(A))、gDHBN(2.7(A))和pDHBN(1.4(A))。進一步的相互作用力和生化特性對比分析顯示高度保守的DHBN結(jié)構(gòu)域主要通過疏水作用力穩(wěn)定存在，并主要負責參與BLM解旋酶的二聚化。溶液中g(shù)DHBN的SAXS測定模型也較好地證實了DHBN的二聚體結(jié)構(gòu)。
　　(3)不同截短gBLM蛋白的凝膠過濾層析分

9、析和DLS測定顯示高度保守的二聚化DHBN是BLM高聚體組裝的基本單位，在此基礎(chǔ)上，本研究提出了之前電鏡研究觀測的hBLM環(huán)狀結(jié)構(gòu)模型。同時，不同截短gBLM蛋白的DNA解旋活性測定和DLS對比分析顯示伴隨著BLM從二聚體被組裝成六聚體，其DNA解旋速率與解旋幅度不斷降低，這暗示了DHBN結(jié)構(gòu)域?qū)NA解旋過程的調(diào)控作用，也揭示了BLM聚體形態(tài)與DNA解旋活性之間的關(guān)系。有趣的是，穩(wěn)定的DHBN二聚體在BLM全長蛋白分子中可由ATP水解