堿性蛋白酶產(chǎn)生菌篩選及其apr基因表達(dá)與酶學(xué)特性研究.pdf

1、本研究從環(huán)境分離到一株堿性蛋白酶產(chǎn)生菌，通過(guò)形態(tài)特征、生理生化和16SrRNA基因序列分析確定菌株的分類地位，并采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)探討其發(fā)酵改良血粉和豆粕飼用品質(zhì)的效果，同時(shí)構(gòu)建其堿性蛋白酶基因的表達(dá)質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒表達(dá)條件和特性進(jìn)行研究，并探索重組酶的部分酶學(xué)性質(zhì)。
　　 1.堿性蛋白酶產(chǎn)生菌的分離和鑒定。為了篩選堿性蛋白酶產(chǎn)生菌并探討其對(duì)蛋白質(zhì)飼料的發(fā)酵效果，以肉粉廠表層土壤為菌株分離源，利用脫脂牛奶培養(yǎng)基分離和純化蛋白酶產(chǎn)生

2、菌，通過(guò)形態(tài)特征、生理生化和16SrRNA基因序列分析確定菌株的分類地位，此堿性蛋白酶產(chǎn)生菌與枯草芽孢桿菌親緣關(guān)系最近，同源性為99.5％，故命名為枯草芽孢桿菌D-2。
　　 2.枯草芽孢桿菌D-2固態(tài)發(fā)酵蛋白飼料效果的研究。采用L9(33)正交設(shè)計(jì)研究篩選出的優(yōu)勢(shì)菌種的接種量(3％、6％和12％)、種子液培養(yǎng)時(shí)間(12h、24h和48h)和固態(tài)發(fā)酵時(shí)間(12h、24h和48h)3因素對(duì)發(fā)酵豆粕和血粉的影響。結(jié)果表明，其最優(yōu)條件

3、為接種量6％、種子液培養(yǎng)時(shí)間24h和發(fā)酵時(shí)間48h，在最優(yōu)條件下，該菌固態(tài)發(fā)酵豆粕及血粉可顯著增加小肽含量至17.06％和12.73％?？莶菅挎邨U菌D-2(BacillussubtilisstrainD-2)所產(chǎn)的堿性蛋白酶能高效降解豆粕和血粉中的蛋白，提高豆粕和血粉的飼用品質(zhì)。
　　 3.枯草芽孢桿菌D-2堿性蛋白酶基因的克隆、表達(dá)。為了建立高產(chǎn)的枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因表達(dá)體系，采用PCR方法從枯草芽孢桿菌D-2中擴(kuò)增等到

4、堿性蛋白酶基因，將其連入表達(dá)質(zhì)粒pET-32a構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-apr-D2。經(jīng)測(cè)序、鑒定后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21構(gòu)建成重組工程菌，并對(duì)該基因和編碼蛋白進(jìn)行同源性比較和誘導(dǎo)表達(dá)條件的研究。結(jié)果表明，堿性蛋白酶基因序列全長(zhǎng)1149bp，編碼382個(gè)氨基酸，SDS-PAGE顯示融合蛋白分子質(zhì)量為60.4kDa。在誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷濃度0.2mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為4h，重組工程菌在27℃表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶形式

5、存在，37℃主要以包涵體形式存在?？扇苄员磉_(dá)產(chǎn)物經(jīng)測(cè)定具有堿性蛋白酶生物活性。
　　 4.重組菌堿性蛋白酶純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究。為了研究重組酶鹽析特性和酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽析和透析除鹽純化得粗酶并研究不同溫度、pH條件和金屬離子、化學(xué)試劑處理下的酶活。鹽析曲線表明在硫酸銨濃度60％時(shí)發(fā)酵液中重組酶幾乎完全析出，酶學(xué)性質(zhì)研究表明該重組酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH為10.5，具有較高的熱穩(wěn)定性，在pH8.0～12.0

6、范圍下都能保存較高的酶活，Ca2+與Mg2+對(duì)酶都有一定的激活作用，而Hg+、Ag+對(duì)酶有明顯的抑制作用，苯甲基磺酰氟(PMSF)和二異丙基氟磷酸(DFP)對(duì)該酶具有強(qiáng)烈抑制作用。
　　 5.枯草芽孢桿菌D-2堿性蛋白酶的核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。為了研究BacillussubtilisstrainD-2的堿性蛋白酶的編碼基因和該酶蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)，本文使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的不同程序、BioEdit軟件、DNAstar軟件、Prot

7、Scale程序、NetPhos2.0Server程序、scratchproteinPredictor程序、TMHMM預(yù)測(cè)、Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)、NetTurnP1.0程序、CBSPredictionServers程序、Pfam預(yù)測(cè)、SMART預(yù)測(cè)、PSORTb程序等，對(duì)核苷酸序列、堿基同源性和開放閱讀框進(jìn)行了分析，并將核酸序列翻譯為氨基酸序列，預(yù)測(cè)和分析了蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，包括氨基酸序列分析、信號(hào)肽預(yù)測(cè)、疏水