膠原酶產(chǎn)生菌的鑒定及所產(chǎn)膠原酶酶學(xué)特性研究.pdf

1、目的：分離、純化并鑒定人初乳樣本中具備蛋白水解能力的菌株，進(jìn)一步確定產(chǎn)酶菌株膠原酶的編碼基因以及分子結(jié)構(gòu)特性，最終利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行原核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)的重組酶進(jìn)行純化以及酶學(xué)性質(zhì)研究。
　　方法：以牛奶平板培養(yǎng)法分離并純化產(chǎn)酶菌株，利用16Sr DNA序列分析以及API CH50培養(yǎng)基分析菌株的遺傳特性與生化特性，最終鑒定產(chǎn)酶菌株所屬類型。其次，利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析產(chǎn)酶菌株所產(chǎn)酶的類型，再結(jié)合質(zhì)譜分析結(jié)果以菌株基因組DN

2、A為模板采用PCR法獲得膠原酶colR75E基因，構(gòu)建pET28a/colR75E重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用Ni-NTA純化的方式獲得高純度ColR75E膠原酶，利用膠原酶譜、膠原酶活力測(cè)定、Ⅰ型膠原蛋白降解產(chǎn)物電泳檢測(cè)等方式對(duì)ColR75E膠原酶的酶學(xué)特性進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：通過16Sr DNA序列分析以及API CH50培養(yǎng)基分析可知人初乳樣本中的產(chǎn)酶菌株為一株蠟樣芽孢桿菌，根據(jù)串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果

3、結(jié)合生物信息學(xué)分析可知產(chǎn)酶菌株所產(chǎn)的蛋白酶為一種可分泌至胞外的膠原酶，對(duì)該酶進(jìn)行基因克隆及原核表達(dá)后，通過Ni-NTA純化獲得的蛋白經(jīng)膠原酶譜、Ⅰ型膠原蛋白降解產(chǎn)物的檢測(cè)時(shí)均表現(xiàn)出膠原蛋白的降解能力。在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)得其比活力為3.62 U/mg，Km為25.55μmol/L（2.93 mg/mL），Vmax為5.71μmol/(mg?min)。ColR75E膠原酶的最適反應(yīng)溫度為45℃，最佳反應(yīng)pH為8.0。此外，ColR75E膠原酶對(duì)

4、于不高于50℃的溫度以及pH6.0-8.0的酸堿度范圍具有良好的穩(wěn)定性。ColR75E膠原酶可被Ca2+激活、但被Zn2+、Pb2+、Fe2+、Mn2+等金屬離子抑制，抑制能力依次為Pb2+＞Zn2+＞Fe2+＞Mn2+。ColR75E膠原酶對(duì)EDTA和EGTA的高敏感性進(jìn)一步證實(shí)了該膠原酶為一種金屬蛋白酶。
　　結(jié)論：本研究分離鑒定了一種可分泌膠原酶的蠟樣芽孢桿菌，構(gòu)建了相應(yīng)膠原酶的原核表達(dá)系統(tǒng)，最終證實(shí)利用原核表達(dá)系統(tǒng)大量獲得