侵襲性牙周炎患者牙齦組織中膠原酶及TIMP-1的表達研究.pdf

1、牙周疾病作為人類口腔發(fā)生率較高的疾病之一，與齲病統(tǒng)稱為人類兩大口腔疾病。侵襲性牙周炎(aggressive periodontitis，AgP)是一類發(fā)病年齡早、病程進展快、破壞程度大、有家族聚集性的牙周疾病。AgP的發(fā)病因素多樣，發(fā)病機制復(fù)雜。越來越多的證據(jù)表明，人類牙周疾病牙周支持組織的破壞過程中，結(jié)締組織的降解和牙槽骨的破壞主要是通過誘導(dǎo)活化宿主細胞酶來實現(xiàn)的?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，M

2、MPs)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitors of metalloroteinases-1，TIMP-1)在牙周疾病中的作用近年來引起眾多學(xué)者的關(guān)注。該組蛋白水解酶主要通過對細胞外基質(zhì)中大分子降解作用的調(diào)節(jié)，參與人體眾多正常的生理過程和病理過程。MMPs與TIMP-1在正常的牙周組織中保持平衡，參與牙周組織的改建。而當(dāng)在某些刺激因子或炎癥的作用下，會引起MMPs發(fā)生過度分泌或其活性被激活，導(dǎo)致MMPs與TIM

3、P-1的比例超出正常所在范圍。研究表明MMPs及TIMPs的失衡可能是激活細胞外基質(zhì)、基底膜細胞過度降解的重要原因，從而導(dǎo)致牙周軟組織和牙槽骨組織膠原的破壞與喪失，進一步導(dǎo)致牙周疾病的發(fā)生。間質(zhì)膠原酶(collagenases)是MMPs的第一大類，主要成員包括MMP-1、MMP-8和MMP-13。其中MMP-1又被稱為成纖維細胞型膠原酶(fibroblastcollagenase，F(xiàn)IB-CL)，主要來源于成纖維細胞、吞噬細胞和上皮細

4、胞等，優(yōu)先降解Ⅲ型膠原。有研究認為MMP-1是局限型侵襲性牙周炎中參與牙周組織破壞的膠原酶，尤其是對膠原降解的始動作用。MMP-8又被稱為中性粒細胞型膠原酶(neutrophil collagenase，PMN-CL)，是目前有關(guān)炎性牙周組織和齦溝液中MMPs表達研究中最多的一種，主要由多形核中性粒細胞產(chǎn)生和分泌，MMP-8主要參與Ⅰ型膠原纖維的破壞，而Ⅰ型纖維膠原又是牙周膜和牙槽骨組織的主要膠原組成成份。MMP-13是上皮組織中首要表

5、達的膠原酶，且在多種牙周組織和細胞中表達，與組織中膠原纖維的快速轉(zhuǎn)變密切相關(guān)，MMP-13對Ⅱ型膠原酶的活性較其他膠原酶更具影響力。TIMP-1是MMPs的內(nèi)源性抑制因子，可以和大多數(shù)MMP結(jié)合，被認為是MMPs的重要內(nèi)源性抑制因子之一。近年來，大量研究表明膠原酶及TIMP-1水平及活性與慢性牙周炎關(guān)系密切，但有關(guān)膠原酶及TIMP-1水平在亞洲人群AgP患者中的研究尚未見報道。
　　 目的：本實驗通過檢測MMP-1、MMP-8、

6、MMP-13及TIMP-1在侵襲性牙周炎牙齦組織中的表達，與牙周臨床指標(biāo)相結(jié)合，了解MMPs及TIMP-1與AgP牙周炎癥程度的相關(guān)關(guān)系，并將MMPs及TIMP-1比值作為新的指標(biāo)進行分析，進一步分析MMPs及TIMP-1的平衡在AgP發(fā)展中的作用。
　　 方法：⑴選擇來自廣東省口腔醫(yī)院牙周科和番禺分院牙周科就診的30例侵襲性牙周炎患者（平均年齡29.37歲）。診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)1999年國際研討會牙周病分類法提出的標(biāo)準(zhǔn)。對照組:選擇

7、來自廣東省口腔醫(yī)院外科就診的因阻生齒、錯位牙、埋伏牙而需要拔牙的20例牙周健康者（平均年齡26.35歲），所有患者無全身性疾病，6個月內(nèi)未服用抗生素，未經(jīng)任何牙周治療等，并簽署知情同意書。⑵對納入患者在其治療前采用Florida探針進行全口牙齒的探查和記錄。記錄指標(biāo)包括菌斑指數(shù)、探診深度、出血指數(shù)、附著喪失，松動度以及根分叉病變，牙周炎患者拍攝全口根尖片。在符合侵襲性牙周炎標(biāo)準(zhǔn)不能保留牙齒拔除過程中獲得牙齦標(biāo)本，對照組在阻生牙等拔除術(shù)中

8、采集牙齦標(biāo)本。蒸餾水沖洗后，置于4％多聚甲醛中固定12～24 h。⑶對固定樣本行脫水，透明，石蠟包埋，制成3 um的連續(xù)切片，采用多聚賴氨酸防脫片，60℃烤片2h。行MMP-1、MMP-8、MMP-13及TIMP-1常規(guī)免疫組織化學(xué)方法檢測。⑷對上述免疫組織化學(xué)結(jié)果進行定位及半定量分析。陽性細胞為細胞漿染色呈黃褐色的細胞。在×400倍光鏡下，每張切片隨機選擇10個有陽性細胞表達的視野拍攝，IPP(Image Pro Plus)圖片分析測

9、量軟件分析。根據(jù)得到的IOD(Integratedoption density)值除以目標(biāo)分布區(qū)域面積，得到MMP-1、MMP-8、MMP-13及TIMP-1的平均光密度值，并計算MMP-1/TIMP-1、MMP-8/TIMP-1、MMP-13/TIMP-1比值。⑸統(tǒng)計學(xué)分析。采用SPSS13.0統(tǒng)計進行分析，計量資料結(jié)果用描述性分析結(jié)果，如(x)±s表示，各項指標(biāo)經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗后，對兩組臨床指標(biāo)及TIMP-1、MMP-1、MM

10、P-8、MMP-13表達情況及MMP-1/TIMP-1、MMP-8/TIMP-1、MMP-13/TIMP-1比值進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)或兩獨立樣本非參數(shù)秩和檢驗。采用Spearman法進行相關(guān)分析，并繪制ROC曲線。檢驗水準(zhǔn)均以α=0.05。
　　 結(jié)果：①TIMP-1、MMP-1、MMP-8和MMP-13在牙齦組織中的表達和分布。①健康的牙齦組織中。TIMP-1在上皮層和固有層中均可觀察到胞漿呈黃褐色

11、的陽性細胞;主要分布區(qū)域是結(jié)締組織區(qū)。MMP-1呈弱表達，在上皮細胞和固有層細胞中可見散在的陽性細胞，且在上皮層內(nèi)的表達呈從棘細胞淺層到棘細胞深層染色強度遞減趨勢。MMP-8和MMP-13在上皮層和固有層中呈弱表達，主要分布區(qū)域為結(jié)締組織區(qū)。②AgP組牙齦組織中。TIMP-1呈弱表達，主要表達部位在炎性結(jié)締組織區(qū);與牙齦健康組相比，差異無顯著意義(P＞0.05)。MMP-1和MMP-8呈強陽性表達，上皮層和固有層中呈現(xiàn)大量密集的胞漿為黃

12、褐色的陽性細胞，主要分布在固有層中炎性細胞密集區(qū)，與牙齦健康組相比，差異有顯著性意義（P＜0.05）。MMP-13呈強陽性表達，上皮層和固有層中大量陽性細胞分布，主要表達部位在炎性細胞浸潤區(qū)，與牙齦健康組相比，差異無顯著性意義(P＞0.05)。②臨床指標(biāo)和實驗指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系。AgP組中MMPs及其與TIMP-1相應(yīng)的比值與臨床指標(biāo)間存在著一定的相關(guān)關(guān)系。MMP-1、MMP-8、MMP-1/TIMP-1及MMP-8/TIMP-1與PD和

13、AL均存在顯著的相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)，MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-1/TIMP-1及MMP-8/TIMP-1與BOP存在顯著的相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。說明MMPs與TIMPs及其比值與AgP的牙周炎癥程度密切相關(guān)，隨著炎癥的加重，MMPs與TIMPs的失衡比也加大。各MMPs之間也存在一定的相關(guān)性:MMP-1與MMP-8、MMP-1與MMP-13及MMP-8與MMP-13之間存在顯著的相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)，提

14、示MMPs及TIMP-1的平衡可能在AgP發(fā)展中起有重要作用。③把MMPs與TIMP-1的比值作為新因素進行分析。根據(jù)ROC曲線分析，AUC(MMP-8/TIMP-1)=0.947＞AUC(MMP-8)=0.752,AUC(MMP-1/TIMP-1)=0.870＞AUC(MMP-1)=0.835，MMPs與TIMP-1的比值的運用，可以大大提高ROC曲線下的面積值A(chǔ)UC，并依據(jù)ROC曲線標(biāo)準(zhǔn)，提示MMP-8/TIMP-1、MMP-1/T