SPINK1調(diào)節(jié)大鼠正常肝細(xì)胞BRL-3A和大鼠肝癌細(xì)胞RH-35增殖的分子機(jī)理及其比較分析.pdf

1、作為一種胰蛋白酶抑制劑，絲氨酸蛋白酶抑制劑Ⅰ(serine peptidase inhibitor, Kazaltype1，SPINK1)的空間結(jié)構(gòu)與表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)的非常相似。研究表明，SPINK1的生物學(xué)功能也類似于EGF，能夠促進(jìn)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的增殖和分化。本實(shí)驗(yàn)室采用大鼠全基因組芯片Rat Genome2302.0檢測(cè)2/3部分肝切除(partial hepatectom

2、y, PH)后再生肝肝細(xì)胞的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)Spink1在肝切除后的6、24和72 h表達(dá)顯著上調(diào)。眾所周知PH后6-72 h肝細(xì)胞增殖明顯，表明Spink1與大鼠再生肝肝細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。基因組芯片檢測(cè)二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DENA)誘導(dǎo)的大鼠肝癌細(xì)胞的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)Spink1在誘導(dǎo)后的12和16w表達(dá)顯著上調(diào)，并且誘導(dǎo)后12-16w肝細(xì)胞增殖明顯，表明Spink1與大鼠肝癌細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。然而

3、，目前對(duì)SPINK1調(diào)控肝再生中肝細(xì)胞，以及肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)理還不完全清楚。研究表明，SPINK1能夠與表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)相結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和遷移等多種生理活動(dòng)。本文通過(guò)免疫共沉淀（immunoprecipitation assay, IP）的方法也發(fā)現(xiàn)SPINK1能夠與EGFR相結(jié)合。最近的研究表明EGFR被生長(zhǎng)因子等激活后，能夠通過(guò)p38MAPK、

4、ERK、JNK、PKC、JAK-STAT和AKT等多條信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖。本文通過(guò)IPA(Ingenuity Pathway Analysis9.0)軟件，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)分析SPINK1與EGFR信號(hào)通路的互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)SPINK1可能與EGFR結(jié)合后通過(guò)上述6條信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的增殖。
　　本研究通過(guò)基因添加的方法處理BRL-3A細(xì)胞，并用重組蛋白處理BRL-3A細(xì)胞和RH-35細(xì)胞，通過(guò)MTT、EdU、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)S

5、PINK1上調(diào)表達(dá)對(duì)上述兩種細(xì)胞活力、增殖和周期等的影響，通過(guò)免疫共沉淀、qRT-PCR和western blot等方法推測(cè)SPINK1調(diào)控兩種細(xì)胞增殖的機(jī)理。結(jié)果表明，通過(guò)基因添加的方法上調(diào)BRL-3A細(xì)胞內(nèi)源性Spink1的表達(dá)后，細(xì)胞的生長(zhǎng)活力和增殖，S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞增殖和抗凋亡相關(guān)基因/蛋白的表達(dá)都明顯增加，然而，G1期的細(xì)胞數(shù)量和促凋亡相關(guān)基因/蛋白的表達(dá)都明顯減少。通過(guò)qRT-PCR和western blot

6、等方法檢測(cè)SPINK1信號(hào)通路相關(guān)基因/蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)p38，ERK和JNK信號(hào)通路相關(guān)基因/蛋白的表達(dá)發(fā)生顯著的變化。當(dāng)用外源性的重組大鼠SPINK1蛋白(rat recombinant SPINK1，rrSPINK1)處理BRL-3A細(xì)胞時(shí)，所得到的結(jié)果與上述結(jié)果相似。當(dāng)用rrSPINK1處理RH-35細(xì)胞時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)與處理BRL-3A細(xì)胞所得到的結(jié)果相似，RH-35細(xì)胞的生長(zhǎng)活力和增殖，S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞增殖和抗凋

7、亡相關(guān)基因/蛋白的表達(dá)都明顯提高，G1期的細(xì)胞數(shù)量和凋亡相關(guān)基因/蛋白的表達(dá)都明顯減少。qRT-PCR和western blot檢測(cè)結(jié)果表明，在RH-35細(xì)胞中，p38和JAK-STAT3信號(hào)通路相關(guān)基因/蛋白的表達(dá)發(fā)生顯著的變化。本文用pEGFR抗體處理穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)源性Spink1的陽(yáng)性單克隆BRL-3A細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞的生長(zhǎng)活力受到明顯的抑制，并且抑制效果隨著抗體劑量的增加愈加明顯，進(jìn)一步驗(yàn)證了SPINK1與EGFR結(jié)合后發(fā)揮其相應(yīng)的