HMGB1在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞HCCLM3增殖和侵襲的影響.pdf

1、目的:肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，在各種惡性腫瘤的死亡率中位居第二。高遷移率族蛋白1(high-mobility group box1，HMGB1)作為一種非組蛋白核蛋白被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中高表達(dá)，但它在肝癌中所扮演的角色目前并不清楚。在本次研究中，我們檢測(cè)肝癌組織中HMGB1的表達(dá)情況，并分析HMGB1 mRNA和肝癌臨床病理因素之間的關(guān)系;探討RNA干擾對(duì)人肝癌細(xì)胞

2、株HCCLM3生物學(xué)活性的影響，并初步研究其可能的下游作用機(jī)制。
　　 方法:(1)收集11例正常肝臟組織、32例肝癌組織及其配對(duì)的癌旁組織，逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和Western-blot分析HMGB1的表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HMGB1的定位，并分析HMGB1 mRNA表達(dá)水平和肝癌臨床病理因素之間的關(guān)系。(2)設(shè)計(jì)并合

3、成了3對(duì)特異性針對(duì)HMGB1的小干擾RNA序列(HMGB1-siRNA-1、HMGB1-siRNA-2和HMGB1-siRNA-3)，通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染HCCLM3細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)和Western-blot檢測(cè)HMGB1干擾序列對(duì)HMGB1表達(dá)的影響;MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖并繪制生長(zhǎng)曲線;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡;Transwell法

4、檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲的能力。(3) Real-time PCR和Western-blot檢測(cè)HMGB1干擾序列轉(zhuǎn)染進(jìn)入HCCLM3細(xì)胞后NF-κB/p65和VEGF-C的表達(dá)水平，間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence)檢測(cè)NF-κB/p65的定位，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)NF-κB/p65的活性。
　　 結(jié)果:(1)

5、 RT-PCR結(jié)果表明HMGB1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在肝癌組織中最高，為0.859±0.159，明顯高于癌旁組織的0.506±0.131和正常肝臟組織的0.413±0.086(P＜0.001)。HMGB1 mRNA的過表達(dá)與肝癌的TNM分期、Edmondson分級(jí)、血管侵犯和包膜侵犯密切相關(guān)。Western-blot結(jié)果顯示HMGB1蛋白在肝癌組織中的表達(dá)也是三組中最高的。相關(guān)性分析表明，組織中的HMGB1 mRNA與HMGB1蛋白表

6、達(dá)呈明顯正相關(guān)(R=0.833，P＜0.01)。此外，免疫組化結(jié)果顯示HMGB1在肝癌中過表達(dá)，免疫染色顆粒主要位于細(xì)胞核，正常肝臟組織中未見染色，在癌旁組織中有少量染色位于細(xì)胞漿。(2) Real-timePCR和Western-blot結(jié)果表明，3條特異性針對(duì)HMGB1的小干擾RNA序列都可以抑制HMGB1的表達(dá)，其中以HMGB1-siRNA-1抑制效率最高。MTT結(jié)果顯示HMGB1-siRNA-1組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯低于陰性對(duì)照組

7、和空白對(duì)照組(P＜0.01);流式細(xì)胞術(shù)顯示HMGB1-siRNA-1組細(xì)胞凋亡顯著增加(P＜0.01); Transwell法結(jié)果表明在HMGB1表達(dá)抑制的HMGB1-siRNA-1組細(xì)胞中，細(xì)胞遷移和侵襲的能力較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯下降(P＜0.01)。(3) Real-time PCR和Western-blot結(jié)果表明，HCCLM3細(xì)胞轉(zhuǎn)染HMGB1-siRNA-1后NF-κB/p65和VEGF-C的表達(dá)較陰性對(duì)照組和空白對(duì)

8、照組明顯下降(P＜0.01);間接免疫熒光法結(jié)果顯示HMGB1-siRNA-1組的NF-κB/p65核轉(zhuǎn)位減少;ELISA結(jié)果顯示HMGB1-siRNA-1組的NF-κB/p65活性降低。
　　 結(jié)論:(1)肝癌組織中HMGB1的表達(dá)明顯升高;肝癌組織中的HMGB1表達(dá)水平與肝癌的TNM分期、Edmondson分級(jí)、血管侵犯、包膜侵犯正相關(guān)，其過表達(dá)可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。(2)特異性針對(duì)HMGB1的siRNA序列可以有