GADD45α調控大鼠肝細胞BRL-3A增殖及其DNA損傷修復的分子機理.pdf

1、研究表明，GADD45α是一種應激誘導的基因，其以低豐度組成型表達，但可通過各種應激刺激（包括紫外線和電離輻射）轉錄激活，并參與調節(jié)細胞周期，凋亡，維持基因組穩(wěn)定性，DNA甲基化切除/修復和免疫應答等。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)GADD45α在大鼠再生肝的肝細胞中表達顯著增強。然而，GADD45α對肝再生的作用和調控機制尚未有報道。為此，本課題擬深入研究GADD45α調控大鼠肝細胞BRL-3A以及DNA損傷誘導后的BRL-3A細胞的分子機理。

2、r>　　為了解GADD45α對大鼠肝再生的作用及調控機理，在基于本實驗室對再生肝基因表達譜分析的基礎上發(fā)現(xiàn)，GADD45α在肝再生啟動階段(0-2 h)和進展階段(6-72 h)各有一個表達高峰，推測它可能參與肝切除后肝細胞的快速增殖，研究表明GADD45α可能與再生肝肝細胞增殖中的DNA損傷修復相關。本文用qRT-PCR驗證了芯片檢測結果的可靠性。用IPA、GenMAPP、KEGG、BIOCARTA、QIAGEN和Biocompare

3、等幾個數(shù)據(jù)庫以及查閱相關文獻構建了GADD45α的信號通路圖并分析其可能的作用機理，表明GADD45α可能通過P38MAPK、JNK、CDC2/CCNB1、P21、AKT和MTOR信號通路調控正常BRL-3A細胞以及FZD/UVC誘導的BRL-3A細胞的增殖、凋亡、周期以及DNA損傷修復。
　　本文通過基因過表達和基因干涉的方法獲得了GADD45α上調表達和下調表達的BRL-3A細胞，對GADD45α調節(jié)正常BRL-3A細胞以及F

4、ZD/UVC誘導的BRL-3A細胞的增殖、凋亡、周期以及DNA損傷修復進行了初步研究。MTT結果顯示過表達GADD45α明顯抑制了BRL-3A細胞的細胞活力，增強了FZD/UVC誘導的BRL-3A細胞的活力，而干涉GADD45α的表達增強了BRL-3A細胞的細胞活力，抑制了FZD/UVC誘導的BRL-3A細胞的活力;EdU結果表明GADD45α過表達抑制了BRL-3A細胞增殖，同時減弱了FZD/UVC對細胞增殖抑制作用，而干涉GADD4

5、5α的表達促進了細胞增殖，同時增強了FZD/UVC對細胞增殖抑制作用。流式細胞術檢測細胞周期結果發(fā)現(xiàn)GADD45α過表達導致正常BRL-3A細胞G1和S期細胞數(shù)量減少，G2/M期阻滯，同時增加了FZD/UVC誘導的S期細胞周期停滯，而干涉GADD45α的表達導致正常BRL-3A細胞G1細胞數(shù)量減少，G2/M和S期期細胞數(shù)量增多，同時減少了FZD/UVC誘導的S期停滯;流式細胞術檢測細胞凋亡結果表明GADD45α過表達對正常BRL-3A細

6、胞凋亡沒有明顯作用，卻抑制了FZD/UVC誘導的BRL-3A細胞的凋亡，干涉GADD45α的表達抑制了正常BRL-3A細胞的凋亡，促進了FZD/UVC誘導的BRL-3A細胞的凋亡;采用qRT-PCR和Western Blot等方法檢測GADD45α表達變化對正常BRL-3A細胞中GADD45α信號通路相關基因/蛋白的表達變化的影響，結果顯示，P38MAPK、JNK、CDC2/CCNB1、AKT和MTOR等信號通路相關基因/蛋白的表達發(fā)生

7、顯著的變化。檢測FZD/UVC誘導的BRL-3A細胞中增殖、凋亡和周期相關基因/蛋白的表達變化的影響，結果顯示，MYC、BCL-2、CCND1、CCNB1、PCNA、P21、CASPASE3、CASPASE8、CASPASE9和BAX等基因/蛋白的表達發(fā)生顯著的變化。表明:GADD45α可能通過P38MAPK、JNK、CDC2/CCNB1、AKT和MTOR等信號通路調控BRL-3A細胞的增殖，通過MYC、BCL-2、CCND1、CCNB