PKB-Akt調(diào)控腫瘤細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)的分子機(jī)制及其靶向小分子抑制劑的研究.pdf

1、背景及目的： 本研究用Akt激酶活性分析法篩選出Excisanin A能在體外抑制Akt激酶的活性，并進(jìn)一步深入探討了Excisanin A通過(guò)抑制Akt活性及阻斷其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在體內(nèi)、外發(fā)揮抗腫瘤作用，為Excisanin A的進(jìn)一步優(yōu)化及研發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 用分子克隆技術(shù)及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株；用免疫熒光技術(shù)或Western blot法觀察細(xì)胞經(jīng)低劑量放射線照射后γ—H

2、2AX聚焦點(diǎn)的形成或γ—H2AX蛋白的表達(dá)情況，并計(jì)數(shù)DNA雙鏈?zhǔn)軗p的陽(yáng)性細(xì)胞；用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Mrell，phospho—Akt，Akt，phospho—GSK3β和β—catenin蛋白的表達(dá)；用RT—PCR法檢測(cè)細(xì)胞中Mrell在mRNA水平的表達(dá)；用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)法檢測(cè)β—catenin/LEF與Mrell啟動(dòng)子序列的特異性結(jié)合作用；用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)Akt及β—catenin是否可以誘導(dǎo)M

3、rell啟動(dòng)子的活性； 結(jié)果： 1、PKB/Akt影響腫瘤細(xì)胞修復(fù)放射線所致的DSBs損傷 1.1抑制PKB/Akt能降低腫瘤細(xì)胞對(duì)DSBs的修復(fù)能力 用4Gy的劑量照射CNE2/vector和CNE2/shRNA Akt1這兩組細(xì)胞使其產(chǎn)生DSBs，然后在不同的時(shí)間進(jìn)行γ—H2AX聚焦點(diǎn)分析。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)照射后30min，這兩組細(xì)胞均呈現(xiàn)顯著的DNA雙鏈斷裂損傷，且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析這兩組細(xì)胞DNA受損的陽(yáng)

4、性細(xì)胞無(wú)區(qū)別。 1.2增強(qiáng)PKB/Akt的活性能提高腫瘤細(xì)胞對(duì)DSBs的修復(fù)能力 用2Gy的劑量照射HeLa/vector和HeLa/myr—Akt1這兩組細(xì)胞使其產(chǎn)生DSBs，然后在不同的時(shí)間進(jìn)行γ—H2AX聚焦點(diǎn)分析。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)照射后30min，這兩組細(xì)胞均呈現(xiàn)顯著的DNA雙鏈斷裂損傷，且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析這兩組細(xì)胞DNA受損的陽(yáng)性細(xì)胞無(wú)區(qū)別。 2、PKB/Akt通過(guò)GSK3β/β—catenin/ LEF-1

5、途徑調(diào)控Mre11的表達(dá) 2.1 PKB/Akt調(diào)控腫瘤細(xì)胞中Mre11的表達(dá) 當(dāng)用特異性靶向Akt1的siRNA或LY294002抑制CNE2細(xì)胞或MDA—MB—43細(xì)胞中Akt的表達(dá)或激活后，Mre11的表達(dá)隨之下調(diào)；而當(dāng)HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染了持續(xù)激活的Akt1質(zhì)粒使Akt的活性增強(qiáng)后，Mre11的表達(dá)隨之上調(diào)；同時(shí)我們構(gòu)建了包含Mre11啟動(dòng)子核心區(qū)域的熒光素酶報(bào)告基因pGL3-Mre11質(zhì)粒并進(jìn)行了活性檢測(cè)。

6、 2.2 PKB/Akt通過(guò)作用于GSK—3β來(lái)參與調(diào)控β—catenin途徑 GSK—3β是Akt下游一個(gè)重要的靶分子。在CNE2細(xì)胞中，當(dāng)Akt的磷酸化水平被LY294002抑制后，GSK—3β的磷酸化水平下調(diào)，β—catenin的表達(dá)也下降；在HeLa細(xì)胞中，外源轉(zhuǎn)入持續(xù)激活型myr—Akt1質(zhì)粒增高細(xì)胞中Akt的磷酸化水平后，GSK—3β的磷酸化水平增加，β—catenin的表達(dá)隨之增強(qiáng)。 2.3β—caten

7、in通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子LEF-1調(diào)控Mre11的表達(dá) 接下來(lái)我們又深入探討了β—catenin與Mre11之間的關(guān)系。當(dāng)用特異性靶向β—catenin的siRNA抑制CNE2細(xì)胞及HeLa/myr—Akt1細(xì)胞中β—catenin的表達(dá)后，Mre11的表達(dá)隨之下調(diào)；而當(dāng)HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染了β—catenin的質(zhì)粒使β—catenin過(guò)表達(dá)后，Mre11的表達(dá)隨之上調(diào)。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示β—catenin/LEF-1能在細(xì)胞內(nèi)與Mre1

8、1啟動(dòng)子區(qū)域的特異序列結(jié)合。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)β—catenin能使pGL3-Mre11的熒光素酶活性增高達(dá)50％，而過(guò)表達(dá)β—catenin卻不能使LEF-1位點(diǎn)發(fā)生突變的pGL3-mtMre11報(bào)告質(zhì)粒的活性增高，這種差別具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組的空白質(zhì)粒相比，共轉(zhuǎn)染β—catenin表達(dá)質(zhì)粒和野生型pGL3-Lef熒光素酶報(bào)告質(zhì)?？梢允篃晒鈾z測(cè)活性增高達(dá)50％；若共轉(zhuǎn)染β—catenin表達(dá)質(zhì)粒和突變型pGL3-

9、mtLef熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，可使增高的活性下降近10倍。這些結(jié)果說(shuō)明β—catenin可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子LEF-1特異性地誘導(dǎo)Mre11啟動(dòng)子的活性，從而上調(diào)Mre11的表達(dá)，也即證實(shí)了Mre11是β—catenin/ LEF-1的轉(zhuǎn)錄靶分子。 3、抑制Mre11的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞修復(fù)放射線引起的DSBs損傷 在實(shí)驗(yàn)中，我們用2Gy放射線照射Mre11受干擾后的細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞使其產(chǎn)生DSBs，然后在不同的時(shí)間進(jìn)行γ—H2

10、AX聚焦點(diǎn)分析。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)照射后30min，這兩組細(xì)胞均呈現(xiàn)顯著的DNA雙鏈斷裂損傷，且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析這兩組細(xì)胞DNA受損的陽(yáng)性細(xì)胞無(wú)區(qū)別。到照射后24小時(shí)，這兩組細(xì)胞的DNA損傷得到了不同程度的修復(fù)，但Mre11表達(dá)受抑制的細(xì)胞中γ—H2AX聚焦點(diǎn)明顯較對(duì)照組細(xì)胞多且大。在另外一組實(shí)驗(yàn)中我們也得到了類(lèi)似的結(jié)果。當(dāng)HeLa細(xì)胞中的Mre11被有效地抑制后，再接受低劑量照射，48小時(shí)后收蛋白，Western blot結(jié)果顯示γ—H2AX

11、的表達(dá)明顯高于對(duì)照組細(xì)胞。以上結(jié)果說(shuō)明抑制Mre11的表達(dá)顯著損害了腫瘤細(xì)胞修復(fù)放射線所致的DSBs損傷的能力。 4、Excisanin A對(duì)Akt激酶活性的影響 用Akt激酶活性分析法篩選靶向Akt的小分子抑制劑，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)ExcisaninA能明顯GSK—3的磷酸化水平，而且隨著藥物濃度的增高，抑制越明顯；在20μM濃度時(shí)，ExcisaninA對(duì)phospho—GSK—3α/β的抑制率達(dá)到84％

12、，而陽(yáng)性對(duì)照藥triciribine為67％。這說(shuō)明ExcisaninA在體外能抑制Akt激酶的活性。 5、Excisanin A誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞和MDA—MB—453細(xì)胞發(fā)生凋亡，并在細(xì)胞內(nèi)抑制Akt的活性及阻斷其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 為探討Excisanin A的體外抗瘤作用及作用機(jī)制，我們選擇了Akt活性高表達(dá)的人肝癌Hep3B細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞MDA—MB—453細(xì)胞為細(xì)胞模型。MTT結(jié)果顯示Excisanin A能

13、顯著抑制Hep3B細(xì)胞及MDA—MB—453細(xì)胞的增殖，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系，其IC50(72 h)值分別為6.5μM(Hep3B細(xì)胞)和10.3μM(MDA—MB—453細(xì)胞)。而且Excisanin A能增強(qiáng)5-FU對(duì)Hep3B細(xì)胞或阿霉素對(duì)MDA—MB—453細(xì)胞的敏感性，其CIs值<1。當(dāng)用Excisanin A處理Hep3B和MDA—MB—453細(xì)胞后，AnnexinV陽(yáng)性的細(xì)胞比例顯著增加，且細(xì)胞核出現(xiàn)典型的凋亡改變。當(dāng)用Exc

14、isaninA處理Hep3B細(xì)胞和MDA—MB—453細(xì)胞后，Western blot結(jié)果顯示胞內(nèi)的Akt、FKHR、GSK—3β、mTOR的磷酸化水平在很短的時(shí)間內(nèi)就被明顯抑制，并呈濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。為進(jìn)一步證實(shí)ExcisaninA在細(xì)胞內(nèi)能抑制Akt的活性，我們建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染激活型myr—Akt1質(zhì)粒的細(xì)胞株Hep3B/myr—Akt1。MTT結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，ExcisaninA能明顯減少Hep3 B/myr—Akt1組

15、中存活的細(xì)胞。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明Excisanin A在Hep3B細(xì)胞和MDA—MB—453細(xì)胞中通過(guò)抑制Akt的活性并使其底物蛋白FKHR、GSK—3β、mTOR去磷酸化，從而阻斷其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。 6、ExcisaninA在體內(nèi)抑制Hep3B裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)并阻斷Akt/FKHR途徑 為探討Excisanin A的體內(nèi)抗瘤藥效及作用機(jī)制，我們建立了Hep3B裸鼠移植瘤模型。結(jié)果顯示，Excisa

16、nin A在20mg/kg/d劑量下能顯著抑制Hep3B裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，其抑瘤率達(dá)到46.4％。將瘤組織制成的冰凍切片進(jìn)行TUNEL染色，在熒光顯微鏡下可觀察到20mg/kg/d Excisanin A處理組可見(jiàn)大量TUNEL染色呈陽(yáng)性的細(xì)胞。而且Western blot及免疫熒光的結(jié)果也顯示20mg/kg/d Excisanin A處理組能抑制Hep3B裸鼠移植瘤中Akt和FKHR的磷酸化水平。這些結(jié)果說(shuō)明Excisanin A在在

17、20 mg/kg/d劑量時(shí)能在體內(nèi)阻斷Akt/FKHR信號(hào)傳導(dǎo)通路，使Akt和FKHR的磷酸化水平降低，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。 結(jié)論： 1、抑制Akt可使腫瘤細(xì)胞修復(fù)放射線所致的DSBs損傷的能力減弱；而增強(qiáng)Akt的活性，可使腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線所致的DSBs損傷的修復(fù)能力增強(qiáng)。 2、抑制Mre11的表達(dá)顯著損害了腫瘤細(xì)胞修復(fù)放射線所致的DSBs損傷的能力。 3、在腫瘤細(xì)胞中，激活的Akt能通過(guò)GSK3β/β