組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA對DNA雙鏈斷裂損傷修復路徑的作用.pdf

1、目的：DNA分子結(jié)構的完整性對細胞生存至關重要。細胞內(nèi)DNA損傷存在多種類型，其中DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break，DSB)對細胞影響最為嚴重，對細胞生存是致命的。通過在腫瘤細胞中產(chǎn)生DNA損傷，誘導腫瘤細胞周期中止、壞死和凋亡是臨床放、化療的主要目的。但細胞中DNA損傷修復路徑的存在，削弱了腫瘤細胞對治療的敏感性。組蛋白去乙?；甘悄壳翱鼓[瘤治療的新靶點，有研究證明，其抑制劑能夠有效抑制腫瘤細胞內(nèi)受損DN

2、A修復，大幅提高腫瘤細胞對放、化療的敏感性，而對人正常細胞影響較小。本研究通過Ⅱ型DNA拓撲異構酶抑制劑，依托泊苷(Etoposide)在乳腺癌MCF-7細胞中誘導產(chǎn)生DSB損傷，探索組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA對腫瘤細胞DSB路徑的影響，初步研究組蛋白去乙酰化酶抑制劑對DSB修復通路的作用機制，并用流式細胞術檢測SAHA對同源染色體指導的重組修復路徑(homologous direct recombination，HDR)的抑制效率

3、，為高效抗腫瘤藥物的開發(fā)提供實驗依據(jù)。
　　 方法：利用Ⅱ型DNA拓撲異構酶抑制劑Etoposide(VP-16)，在乳腺癌細胞MCF-7中誘導DSB損傷產(chǎn)生，免疫熒光檢測DSB損傷標志物-磷酸化變異組蛋白H2A(histone variant H2A phosphorylated at serine139，γ-H2Ax)的生成。DNA瓊脂糖電泳，觀察VP-16作用MCF-7細胞后基因組DNA斷裂產(chǎn)生的涂抹狀Smear條帶形成，

4、佐證DSB損傷的存在。細胞克隆形成實驗觀察SAHA對VP-16誘導的DSB損傷修復的影響。使用CCK-8試劑盒檢測組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA對腫瘤細胞MCF-7及人正常細胞HEK293的細胞增殖毒性作用。Real-TimePCR檢測SAHA的加入，對DSB修復相關基因mRNA表達的影響，Western-Bloting檢測SAHA對DSB修復蛋白在染色體結(jié)合蛋白水平上的改變。流式細胞儀定量檢測SAHA對HDR路徑修復效率的改變。

5、>　　 結(jié)果：⑴DNA拓撲異構酶抑制劑Etoposiden(VP-16)可在MCF-7細胞中有效誘導產(chǎn)生DSB損傷。⑵組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA可抑制MCF-7細胞內(nèi)DSB修復能力，但SAHA對人正常細胞HEK293無顯著抑制作用，并且這一現(xiàn)象與SAHA抑制HDR及C-NHEJ路徑關鍵修復基因rad51、kuS0、rpa70的mRNA水平表達，下調(diào)修復蛋白Rad51、Ku80、RPA70在染色體損傷位點結(jié)合能力相關。⑶流式細胞儀檢

6、測SAHA對MCF-7細胞中HDR路徑修復效率抑制呈劑量依賴，0.5μM、1.5μM及4.5μM藥物可使HDR路徑修復效率分別下降9.9％、42.3％和64.7％
　　 結(jié)論：①乳腺癌MCF-7相對于人對正常細胞HEK293細胞，對SAHA的細胞毒性作用更為敏感。②SAHA可下調(diào)HDR及C-NHEJ路徑關鍵修復基因rad51、ku80、rpa70的mRNA水平表達，并干擾修復蛋白Rad51、Ku80、RPA70結(jié)合于染色體損傷位