組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA拮抗腎草酸鈣結(jié)晶形成及其機制研究.pdf

1、背景和目的：隨著現(xiàn)代生活水平的提高、生活方式的改變，環(huán)境、代謝因素相關(guān)的疾病日趨凸顯。作為泌尿科常見疾病之一，腎結(jié)石(kidney stones)，不僅給患者帶來疼痛、手術(shù)的痛苦、沉重的經(jīng)濟負擔(dān)，而且給腎臟功能也帶來進行性惡化的遠期影響。因此對于早期防治腎結(jié)石的發(fā)生發(fā)展就顯得尤為重要。最常見的腎結(jié)石類型是含鈣結(jié)石，其中草酸鈣結(jié)石所占比例將近80％[3]。腎結(jié)晶是腎結(jié)石早期階段的表現(xiàn)形式，當(dāng)前有許多的研究主要集中在探索腎結(jié)晶的防治。草酸鈣

2、結(jié)晶生成的病理生理過程如下:草酸鈣晶體刺激腎小管上皮細胞，激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶，產(chǎn)生活性氧，進而使親環(huán)蛋白D（Cyclophilin D）活化，繼而發(fā)生線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開放，誘導(dǎo)線粒體坍塌，活性氧進一步增多，機體處于較高的氧化應(yīng)激狀態(tài)，細胞色素C由坍塌的線粒體釋放繼而激活Caspase3，這些反應(yīng)最終導(dǎo)致小管上皮細胞損傷乃至凋亡，改變細胞膜上磷脂酰絲氨酸的分布，從而促進晶體與小管上皮細胞的粘附，

3、促成大量的腎結(jié)晶。于是通過抗氧化、抗凋亡等途徑可有效得減少腎結(jié)晶沉積，減輕結(jié)晶腎損傷。
　　與遺傳?。℅enetic diseases）相對應(yīng)，表觀遺傳學(xué)疾病(Epigenetic diseases)是指DNA序列未改變而蛋白質(zhì)表達異常的疾病[5]，在環(huán)境相關(guān)疾病中起到很重要的作用。組蛋白修飾是表觀遺傳現(xiàn)象(Epigenetics)之一，包括組蛋白磷酸化、泛素化、甲基化、乙?；痆5][6]，而組蛋白乙?；?去乙?；瘜φ{(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄

4、活化發(fā)揮著重大的作用。組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶與去乙?；腹餐{(diào)控著組蛋白乙酰化/去乙?；膭討B(tài)平衡，當(dāng)前有研究發(fā)現(xiàn)，抑制組蛋白去乙?；缚梢员Ｗo腎臟功能，表現(xiàn)在改善腎臟纖維化、抑制炎癥反應(yīng)、減少小管上皮細胞凋亡，并且在急性腎損傷(Acute KidneyInjury)方面取得較好的研究進展[8]，提高腎功能恢復(fù)的能力。
　　大多數(shù)疾病的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激有著千絲萬縷的聯(lián)系，抑制氧化應(yīng)激程度能延緩病程的進展以及逆轉(zhuǎn)某些疾病的惡化。核轉(zhuǎn)錄

5、因子（紅細胞來源2）相關(guān)因子2(即Nrf2)是介導(dǎo)抗氧化反應(yīng)起保護作用的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它主要是通過激活抗氧化蛋白的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用的。生理情況下，Nr2是與胞質(zhì)中Keap1蛋白相偶聯(lián)，當(dāng)機體受到氧化應(yīng)激損傷時，活性氧族(Reactive Oxygen Species，ROS)產(chǎn)物增多，促使Keap1-Nrf2解偶聯(lián)，Nrf2迅速進入細胞核，啟動抗氧化蛋白表達。既往有關(guān)腎結(jié)晶的體內(nèi)、外研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)晶形成的過程中，隨著成石因素逐漸強于抑石因

6、素，氧化應(yīng)激水平增強，而機體本身的抗氧化能力逐漸減弱，如果能從外界給予機體抵抗氧化應(yīng)激的支持，那么就可以減輕腎小管上皮細胞損傷，阻斷結(jié)晶的進一步生長。研究表明，在腦缺血再灌注動物模型中，用組蛋白去乙?；敢种苿?Histone deacetylaseinhibitor，HDACI)進行干預(yù)后可激活Nrf2的表達及上調(diào)它的下游蛋白分子而起到保護神經(jīng)的作用。
　　基于抑制組蛋白去乙?；改芷鸬娇估w維化、抗炎、抗氧化等作用，再結(jié)合腎結(jié)晶

7、的發(fā)病機制，本課題是以乙醛酸鹽(Glyoxyate)來制造草酸鈣(calcium oxalate，CaOx)腎結(jié)晶的動物模型，并預(yù)先給予雄性小鼠腹腔注射辛二酰苯胺異羥肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA），擬驗證SAHA對小鼠草酸鈣結(jié)晶腎損傷的預(yù)防性保護性效應(yīng)，并進一步探討相關(guān)的保護性機制，為臨床防治腎結(jié)晶損傷提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　內(nèi)容和方法：
　　一、觀察SAHA對草酸鈣結(jié)晶形

8、成的作用，以及對腎模型小鼠腎功能的影響6周齡的ICR雄性小鼠24只，體重20-25克，飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)動物中心SPF級動物房。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機分為4組:A.正常對照組(Control組)B.乙醛酸鹽+生理鹽水組（Saline組）C.乙醛酸鹽+DMSO組（DMSO組）D.乙醛酸鹽+SAHA組（SAHA組），每組6只。A組為空白對照組，不進行任何處理;B、C、D組為實驗組，分別予以Saline、DMSO、SAHA50mg/kg/d腹

9、腔注射，間隔6小時后均予以乙醛酸鹽100mg/kg/d腹腔注射，所有小鼠自由飲食飲水，以上處理連續(xù)7天后四組小鼠均入代謝籠，留取24小時尿液，內(nèi)眥靜脈取血，用生理鹽水行心室灌流，取一側(cè)腎臟組織置于EP管中凍存于-80℃冰箱，以待檢測鈣含量，另一側(cè)腎臟組織內(nèi)固定后浸泡于甲醛中，以待制石蠟切片，行馮庫薩(Von kossa)鈣鹽染色。
　　1.通過測定腎臟組織鈣含量，尿鈣/肌酐比值，觀察Von kossa染色及對各組鈣鹽沉積的半定量分

10、析，來評定SAHA對草酸鈣結(jié)晶形成的作用。
　　2.用自動生化分析來儀檢測各組小鼠的血清肌酐和血尿素氮，ELISA法檢測血清和尿液中KIM-1(kidney injury molecular1)的表達水平，明確SAHA對結(jié)晶腎損傷的影響。
　　二、研究SAHA減輕腎損傷的可能的保護性機制動物處理同第一部分，仍然分為4組:A.Control組B.Saline組C.DMSO組D.SAHA組，每組6只，A組不處理，B、C、D組分別

11、予以Saline、DMSO、SAHA50mg/kg/d腹腔注射，間隔6小時后均予以乙醛酸鹽100mg/kg/d腹腔注射，以上處理連續(xù)7天后小鼠脊椎脫臼處死，用生理鹽水行心室灌流，一側(cè)腎臟組織置于EP管中凍存于-80℃冰箱，以待檢測MDA（丙二醛）、SOD（超氧化物歧化酶）、GSH（谷胱甘肽還原酶）的含量或活力，Western blot檢測Caspase-3蛋白表達水平，另一側(cè)腎臟組織浸泡于甲醛中，以待制石蠟切片，行免疫組化染色和TUNE

12、L染色。
　　1.檢測各組小鼠腎臟組織的MDA、SOD、GSH含量或活力（比色法）來評價SAHA對模型小鼠氧化應(yīng)激水平的影響。
　　2.觀察比較各組OPN（骨橋蛋白）和CD44在腎臟組織中的表達情況。
　　3.檢測SAHA對腎小管上皮細胞凋亡的影響:觀察腎臟組織的TUNEL染色，并對TUNEL陽性細胞行半定量分析，以及比較各組小鼠腎臟中Caspase-3的蛋白表達量。
　　結(jié)果：
　　一、SAHA減少腎結(jié)晶

13、的形成，改善腎功能
　　1.Control組沒有鈣鹽沉積，Saline和DMSO干預(yù)的模型組的鈣含量比Control組明顯增多;與Saline和DMSO干預(yù)的模型組比較，SAHA干預(yù)的模型組小鼠腎組織的鈣含量顯著減少，且尿鈣/肌酐比值明顯降低，Von kossa染色結(jié)果顯示Control組沒有結(jié)晶生成，SAHA組的沉積在腎小管管腔中的鈣鹽比Saline和DMSO組減少，而Saline與DMSO干預(yù)組組間比較沒有差異，這些都證實了草

14、酸鈣結(jié)晶形成被SAHA拮抗。
　　2.與Saline和DMSO干預(yù)的模型組相比，SAHA組的血肌酐、血尿素氮濃度下降，尿KIM-1排泄量也明顯減少，說明SAHA對腎功能有保護作用。
　　二、SAHA減輕草酸鈣結(jié)晶腎損傷的相關(guān)機制
　　1.與Saline和DMSO干預(yù)的模型組比較，SAHA干預(yù)的模型組小鼠腎組織的MDA含量顯著減少，而SOD、GSH的活力在四組小鼠腎臟組織中沒有明顯差異。
　　2.Control組沒

15、有TUNEL陽性細胞，與Saline和DMSO干預(yù)的模型組相比，SAHA干預(yù)的模型組中TUNEL陽性細胞顯著減少，Caspase-3表達水平也明顯降低。
　　3.Control組腎臟組織中有少量的OPN表達，胞漿呈不同程度的黃染，Saline和DMSO干預(yù)的模型組表達上調(diào)，而SAHA干預(yù)的模型組表達量明顯下調(diào);CD44在Control組表達很少，也是由胞漿表達，在Saline和DMSO干預(yù)的模型組中表達上調(diào)，而SAHA干預(yù)的模型組

16、表達量顯著下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.SAHA可減少模型小鼠腎臟組織的腎結(jié)晶形成。
　　2.SAHA可改善草酸鈣結(jié)晶模型小鼠的腎損害。
　　3.SAHA降低模型小鼠腎臟組織的氧化應(yīng)激水平。
　　4.SAHA抑制腎小管上皮細胞凋亡。
　　5.SAHA下調(diào)模型小鼠腎組織的OPN、CD44的表達水平本課題首次將組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA應(yīng)用于草酸鈣腎臟結(jié)晶小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)SAHA能減少腎結(jié)晶的形成、減輕