基底-細(xì)胞系統(tǒng)剛度對(duì)肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、肝癌是我國(guó)惡性腫瘤中死亡率最高的癌癥之一。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，肝癌組織的硬度逐漸升高，肝癌的發(fā)展過程可以看作是腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)硬化組織環(huán)境的一個(gè)病態(tài)響應(yīng)過程，其中腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)病灶向臨近組織侵襲，以及借血路和淋巴道向遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移均涉及細(xì)胞的遷移行為。腫瘤細(xì)胞的遷移依賴于腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)之間特殊的理化作用。當(dāng)細(xì)胞與基底接觸，細(xì)胞通過粘附分子將細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)耦聯(lián)在一起。這樣，ECM

2、-粘附分子-細(xì)胞骨架-細(xì)胞核形成了一個(gè)完整的大骨架網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。大骨架網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)作為“力學(xué)感受器”，使細(xì)胞可感知細(xì)胞外的力學(xué)信號(hào)變化，并沿此“軌道”實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的雙向傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移。除了基底剛度的改變，由于腫瘤細(xì)胞骨架發(fā)育的缺陷，腫瘤細(xì)胞的硬度比同組織來源的正常細(xì)胞低。腫瘤組織的硬化和腫瘤細(xì)胞的軟化將影響細(xì)胞與其所黏附基底之間的力平衡。這些改變是否會(huì)影響細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外信號(hào)的感知和傳遞，并對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移行為產(chǎn)生怎樣的影響仍不清楚。

3、本研究通過分析高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株(HCCLM3，簡(jiǎn)稱M3)對(duì)不同基底剛度的響應(yīng)來研究基底剛度和細(xì)胞剛度的相互作用對(duì)肝癌細(xì)胞遷移行為的影響，并以肝細(xì)胞(L02)作為對(duì)照。我們的主要研究?jī)?nèi)容包括：
　　 ①基于體系最小自由能原則構(gòu)建數(shù)學(xué)模型來模擬不同硬度基底上細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果顯示，細(xì)胞的形態(tài)是通過細(xì)胞-基底系統(tǒng)中介面能和張力能之間的競(jìng)爭(zhēng)，由系統(tǒng)最小自由能來調(diào)控的。當(dāng)基底的化學(xué)環(huán)境因素保持不變時(shí)，細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定性由細(xì)胞-基底系統(tǒng)的剛度

4、決定。細(xì)胞形態(tài)對(duì)基底剛度呈雙向響應(yīng)，響應(yīng)的范圍取決于細(xì)胞外配體的濃度。細(xì)胞對(duì)基底剛度的響應(yīng)范圍可來用來估測(cè)細(xì)胞的“內(nèi)在硬度”。
　　 ②通過制備不同硬度的聚丙烯酰胺基底，觀察正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞在不同的基底剛度和配體濃度上細(xì)胞骨架裝配，鋪展面積，周長(zhǎng)，和形態(tài)因子的變化。并用原子力顯微鏡檢測(cè)基底剛度對(duì)細(xì)胞剛度的影響。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)學(xué)模型中的預(yù)測(cè)相符合。細(xì)胞周長(zhǎng)和投影面積的增長(zhǎng)以及肌動(dòng)蛋白骨架纖維的裝配都依賴于基底剛度。在一

5、定的硬度范圍內(nèi)(細(xì)胞對(duì)基底剛度響應(yīng)的敏感區(qū)域)細(xì)胞的周長(zhǎng)，投影面積的增長(zhǎng)和肌動(dòng)蛋白骨架纖維的裝配與基底剛度呈函數(shù)關(guān)系。胞外配體濃度的增加使細(xì)胞對(duì)基底剛度敏感響應(yīng)的范圍縮小?；谠诓煌捕然咨霞?xì)胞形態(tài)的變化，通過細(xì)胞因子的變化趨勢(shì)來預(yù)估細(xì)胞的“內(nèi)在硬度”發(fā)現(xiàn)正常肝細(xì)胞的硬度高于高轉(zhuǎn)移的肝癌細(xì)胞，這與原子力顯微鏡所檢測(cè)鋪展細(xì)胞的“表觀硬度”結(jié)果相一致。
　　 ③利用不同硬度聚丙烯酰胺基底研究基底剛度和細(xì)胞剛度的相互作用對(duì)正常肝細(xì)胞

6、和肝癌細(xì)胞遷移速度的影響。首先用原子力顯微鏡分別檢測(cè)肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞在不同硬度基底上細(xì)胞模量的變化。接著，用免疫熒光和Western Blot的方法檢測(cè)不同硬度基底上細(xì)胞骨架纖維的交聯(lián)程度。最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面整合素β1的表達(dá)。結(jié)果顯示，肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞可調(diào)整其自身硬度與所黏附基底剛度相適應(yīng)，但是二者的調(diào)節(jié)能力不同。肝細(xì)胞響應(yīng)的硬度范圍大約從3.6 kPa到非常硬的玻璃基底，而肝癌細(xì)胞響應(yīng)的硬度范圍相對(duì)較軟，大約從1.1 kPa

7、到33.7kPa。在這個(gè)硬度范圍內(nèi)，細(xì)胞actin纖維的裝配和整合素β1的表達(dá)有明顯的增加。對(duì)細(xì)胞遷移的分析發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞在相對(duì)較硬(33.7kPa)的基底上運(yùn)動(dòng)比較快，而肝癌細(xì)胞則在相對(duì)較軟(3.6 kPa)的基底上運(yùn)動(dòng)比較快。這些結(jié)果提示肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞對(duì)基底剛度不同的響應(yīng)能力可能造成了與其細(xì)胞骨架的裝配和整合素β1的表達(dá)的差異相關(guān)從而影響細(xì)胞的遷移速度。
　　 ④利用不同硬度的聚丙烯酰胺基底研究基底剛度和細(xì)胞剛度的相互作用對(duì)

8、細(xì)胞遷移模式的影響。通過原子力顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞剛度，time-lapse顯微鏡記錄不同硬度基底上細(xì)胞形態(tài)和遷移的變化，并用免疫熒光技術(shù)觀察基底剛度對(duì)細(xì)胞骨架排列的影響?；讋偠葘?duì)細(xì)胞cofilin和整合素β1表達(dá)的影響用Western Blot檢測(cè)，細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)的表達(dá)用明膠酶譜法檢測(cè)，并用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞在三維基質(zhì)中的侵襲效率。結(jié)果顯示，硬基底可

9、通過促進(jìn)細(xì)胞骨架裝配，增加細(xì)胞剛度，并通過調(diào)節(jié)MMPs分泌和整合素的表達(dá)等來促進(jìn)細(xì)胞間充質(zhì)樣的遷移；而軟基底則可以通過形成皮質(zhì)下環(huán)狀排列的骨架纖維，提高細(xì)胞的柔韌性，減少M(fèi)MPs的分泌和整合素的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞阿米巴樣的遷移，從而提高細(xì)胞的侵襲效率。其中肝細(xì)胞可在硬基底上以典型的間充質(zhì)樣運(yùn)動(dòng)方式遷移，但肝癌細(xì)胞卻不能。與之相反的，軟基底可誘導(dǎo)大多數(shù)肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出阿米巴樣遷移的潛能而只有少數(shù)肝細(xì)胞表現(xiàn)出阿米巴運(yùn)動(dòng)的活力。這些結(jié)果提示基底的硬

10、度，它作為一個(gè)力學(xué)調(diào)控因子，可以放大細(xì)胞的間充質(zhì)或阿米巴運(yùn)動(dòng)的潛能。但是細(xì)胞是選擇一種遷移模式或者是幾種遷移模式的混合，則主要取決于細(xì)胞自身的特性(如細(xì)胞剛度和相關(guān)蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)水平)。
　　 基于以上的研究結(jié)果我們認(rèn)為在細(xì)胞對(duì)基底剛度的感知和響應(yīng)中，基底剛度和細(xì)胞剛度的共同作用比單一的基底剛度起的作用更重要?；讋偠群图?xì)胞剛度作為一種物理因素，主要影響細(xì)胞對(duì)基底剛度的感知范圍，并在不同的硬度范圍內(nèi)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)蛋白的表達(dá)水平從而