必特螺旋霉素生物合成調(diào)控的研究.pdf

1、必特螺旋霉素(Bitespiramycin，BT)已完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)，4"位的異戊?；梢栽黾悠浣M織濃度和體內(nèi)抗菌活性，延長抗生素的半衰期，臨床研究結(jié)果表明，對上呼吸道細(xì)菌感染具有很好的療效，且口服劑量低，不良反應(yīng)少。本文對BT生物合成基因進(jìn)行深入研究，為提高BT產(chǎn)量提供了重要依據(jù)。
　　通過生物信息學(xué)分析，從BT產(chǎn)生菌的全基因組序列中得到BT的生物合成基因簇，在基因簇中有4個內(nèi)源調(diào)控基因和一個外源調(diào)控基因acyB2,其中orf2

2、3和orf42與生二素鏈霉菌S.ambofaciens中的srm22和srm40基因同源，二者都是螺旋霉素(Spiramycin，SP)生物合成的正調(diào)控基因，acyB2與srm40也互為同源基因。對acyB2、srm40和srm22基因在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)研究，只成功表達(dá)表達(dá)并純化出Srm22可溶性蛋白，EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)Srm22蛋白能與srm40和外源調(diào)控基因acyB2的啟動區(qū)進(jìn)行結(jié)合，卻不能與自身啟動區(qū)以及基因簇內(nèi)其它結(jié)構(gòu)基因的

3、啟動區(qū)結(jié)合。這說明Srm22不是直接調(diào)控結(jié)構(gòu)基因，而是通過調(diào)控srm40和acyB2來影響B(tài)T的生物合成。
　　通過生物信息分析推測出全局性調(diào)控基因：亮氨酸響應(yīng)蛋白基因（lrp）和光禿家族基因（bldD），兩者都參與調(diào)控BT的生物合成。在大腸桿菌中表達(dá)并純化出Lrp和BldD蛋白，EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Lrp能與acyB2、srm40和srm22的啟動區(qū)結(jié)合，說明Lrp可能對這三個調(diào)控基因具有調(diào)控作用;而BldD與acyB2、srm2

4、2基因的啟動區(qū)沒有特異性結(jié)合，說明BldD不直接影響這些調(diào)控基因的表達(dá)。
　　在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加L-Leu能明顯提高發(fā)酵產(chǎn)物中BT的比例，在生物合成途徑上L-Leu與BT的異戊酰基側(cè)鏈合成密切相關(guān)。Lrp蛋白參與多個代謝途徑的調(diào)控，其中包括L-Leu的生物合成，我們刪除Lrp的L-Leu結(jié)合結(jié)構(gòu)域，希望解除L-Leu生物合成的反饋抑制，增加異戊?；孜?。我們利用HPLC檢測SP及BT產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)在Δlrp-SP變株中，SP總比例由原

5、株的76.3％提高至81.5％，其中SPⅢ產(chǎn)量提高了88.6％，在Δlrp-BT變株中，ISP總比例由原株的17.7％提高至18.9％，其中ISPⅢ產(chǎn)量提高了212.1％，說明刪除Lrp的L-Leu結(jié)合結(jié)構(gòu)域能提高SP與BT的產(chǎn)量與組分比例。氨基酸含量結(jié)果表明，Δlrp-SP變株內(nèi)BCAAs(Val：32.0μg/g;Leu：37.8μg/g;Ile：13.5μg/g)比原株內(nèi)BCAAs(Val：65.1μg/g;Leu：62.6μg/

6、g;Ile：25.1μg/g)含量低，說明刪除Lrp的L-Leu結(jié)合結(jié)構(gòu)域能增加菌體內(nèi)BCAAs的分解代謝。通過轉(zhuǎn)錄組分析，我們發(fā)現(xiàn)BT和SP生物合成途徑，丙氨酸生物合成途徑，酰基輔酶A代謝途徑等相關(guān)基因表達(dá)量提高。
　　BT化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有三個糖基，這些糖基對抑菌活性至關(guān)重要，orf21基因（NDP-氨基己糖N二甲基轉(zhuǎn)移酶基因），推測其參與BT左側(cè)糖基福洛氨糖的生物合成，為了證實(shí)其功能，我們將orf21基因進(jìn)行阻斷，經(jīng)過抑菌活性測