春雷霉素生物合成調(diào)控及高產(chǎn)菌株改造.pdf

1、春雷霉素是由春雷鏈霉菌（Streptomyces kasugaensis）產(chǎn)生的一種重要的氨基糖苷類抗生素，能與細菌核糖體30S小亞基結(jié)合，通過有效抑制蛋白合成的肽鏈延長來發(fā)揮殺菌功能，因而作為高效廣譜低毒的生物農(nóng)藥被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)病害防治。春雷霉素生物合成基因簇于2006年被報道，但迄今為止其生物合成和調(diào)控機制的研究十分有限。本研究在春雷霉素生物合成基因簇的左翼序列鑒定了五個與春雷霉素生物合成調(diào)控相關(guān)的基因：途徑特異性正轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子

2、kasT，雙組份調(diào)控系統(tǒng)kasW/kasX，MerR家族負轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子kasV和推測編碼異戊烯半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶的基因kasS。
　　KasT蛋白與鏈霉素生物合成的途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子StrR高度同源，前期研究顯示KasT可以結(jié)合春雷霉素生物合成基因的啟動子區(qū)。我們首次建立了春雷鏈霉菌BCRC12349（Streptomyces kasugaensis BCRC12349，LY）的遺傳操作系統(tǒng)，成功敲除了 kasT。kasT缺失后

3、春雷霉素不再產(chǎn)生，春雷霉素合成基因的表達量劇烈下降，kasT回補后春雷霉素恢復產(chǎn)生，而kasT加倍后可以將低產(chǎn)菌株LY中的春雷霉素產(chǎn)量提高3倍。這是第一次通過體內(nèi)實驗證明了kasT是春雷霉素生物合成的途徑特異性正調(diào)控因子。
　　KasW和KasX分別與雙組份調(diào)控系統(tǒng)LuxR家族的應(yīng)答蛋白和組氨酸激酶具有很高的同源性。我們通過基因敲除和轉(zhuǎn)錄分析鑒定了kasW和kasX的功能。kasW、kasX缺失突變株中春雷霉素的產(chǎn)量分別提高了12

4、%和19%，qRT-PCR結(jié)果顯示，突變株中春雷霉素生物合成基因表達量均顯著提高，說明kasW/X是春雷霉素生物合成的負調(diào)控基因；KasV蛋白與MerR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子同源性較高，kasV突變使春雷霉素產(chǎn)量提高194%，生物合成相關(guān)基因的表達量提高4-8倍，表明kasV是春雷霉素生物合成的關(guān)鍵負調(diào)控基因；kasS與kasV位于同一個轉(zhuǎn)錄單元，KasS與異戊烯半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶具有較高的同源性。通過基因敲除和轉(zhuǎn)錄分析，我們發(fā)現(xiàn)kasS缺

5、失使春雷霉素的產(chǎn)量提高22%，春雷霉素生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平提高3-9倍，說明 kasS與春雷霉素生物合成調(diào)控間接負相關(guān)。因此，我們證明在低產(chǎn)菌株LY中敲除負調(diào)控基因kasW/kasX/kasV/kasS或加倍表達正調(diào)控基因kasT，可以有效地提高春雷霉素的產(chǎn)量。
　　基于在低產(chǎn)菌株中成功的產(chǎn)量提高策略，我們嘗試對高產(chǎn)的春雷霉素產(chǎn)生菌小金色鏈霉菌XM301（Streptomyces microaureus XM301，HY）進

6、行基因工程改造。高產(chǎn)菌株HY的春雷霉素產(chǎn)量是低產(chǎn)菌株LY的10倍以上。初步的基因組序列比對發(fā)現(xiàn)二者基因組具有高度相似性，而且春雷霉素生物合成基因簇序列完全相同。在高產(chǎn)菌株HY中敲除kasW/kasX，春雷霉素產(chǎn)量提高了58%，但是高表達kasT并未導致春雷霉素產(chǎn)量的明顯變化；kasV的缺失突變株中春雷霉素生物合成基因的表達量提高了4-8倍，但是產(chǎn)量并沒有明顯變化；kasS突變株的春雷霉素產(chǎn)量下降了43%，春雷霉素生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水

7、平明顯降低，這與低產(chǎn)菌株中kasS的調(diào)控功能相反。
　　為了尋找低產(chǎn)菌株和高產(chǎn)菌株調(diào)控功能差異的原因，我們進行了高產(chǎn)菌株HY和低產(chǎn)菌株LY的全基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測定。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，高產(chǎn)菌株HY中的春雷霉素生物合成基因表達量是低產(chǎn)菌株LY的40-80倍，暗示高產(chǎn)菌株中春雷霉素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄已經(jīng)處于一個較高的水平，繼續(xù)提高其轉(zhuǎn)錄具有一定局限性，應(yīng)該考慮其他的春雷霉素生物合成相關(guān)因子并加以改造。
　　綜上所述，本研究在春雷霉