井崗霉素的生物合成及途徑改造.pdf

1、井岡霉素是一類氨基環(huán)醇類抗生素，包含一個有效烯胺結構，在亞洲被廣泛應用于水稻紋枯病的防治，同時也用于有效烯胺的化學合成，有效烯胺進而作為治療二型糖尿病藥物伏格列波糖的前體。井岡霉素的生物合成途徑的闡明對于更加有效的利用這一化合物有重要的意義。在前期工作中，井岡霉素的生物合成基因簇已得到克隆并測序。測序的區(qū)域共45kb，通過BLAST分析確定了27個開放閱讀框。為確定此基因簇的正確性及完整性，我們將分別包含valABC和valKLMN的兩

2、個操縱子克隆到一個整合型載體pSET152上，并轉入異源宿主變鉛青鏈霉菌1326中。在整合了以上七個基因的變鉛青鏈霉菌衍生菌株的發(fā)酵液中檢測到了有效氧胺A。進一步將編碼糖基轉移酶的基因vaIG轉入此衍生菌株中，發(fā)酵后檢測到了井岡霉素A的產生。此結果說明valABCKLMN這七個基因能夠滿足有效氧胺A的合成，而ValG是負責最后一步將有效氧胺A糖基化合成井岡霉素A的糖基轉移酶。 在井岡霉素A的合成途徑中，前期研究證實ValA是負責

3、催化磷酸戊糖途徑中的7-磷酸景天庚酮糖轉化為2-表-5-表-有效醇酮的環(huán)化酶，是井岡霉素A合成途徑中的第一步。而在本研究中通過體外酶活實驗確認功能基因ValD是表異構化酶，負責催化2-表-5-表-有效醇酮異構化生成5-表-有效醇酮。當以7-磷酸景天庚酮糖為底物，ValA單獨存在時，只生成2-表-5-表-有效醇酮；當ValA與ValD同時存在時生成5-表-有效醇酮。序列分析發(fā)現(xiàn)它屬于VOC家族。類似于此家族的其它成員，ValD的每個活性位

4、點分別由兩個βαβββ模塊構成；ValD的單聚體具有兩個活性位點，且以二聚體的形式存在，因此它是VOC家族中目前發(fā)現(xiàn)的最大的成員。 前期工作證實有效烯酮和有效酮是反應的中間產物，激酶ValC可以將這兩個化合物磷酸化。但是其他中間產物沒有被分離到或經過嚴格的體外酶活實驗證實。氧化還原酶基因valN的缺失突變株發(fā)酵可產生1，1'-雙-有效烯胺和有效烯霉素，分別比有效氧胺A和井岡霉素A多了一個雙鍵，表明ValN負責催化井岡霉素A中C-

5、5/C-6位的雙鍵的還原，以有效烯酮或者7-磷酸有效烯酮為底物催化合成有效酮或者7-磷酸有效酮。 唯一負責編碼轉氨酶的基因valM的缺失突變株發(fā)酵不能產生井岡霉素A或者有效氧胺A，表明它和井岡霉素合成相關，推測它負責井岡霉素A中氮原子的引入，以7-磷酸有效酮為底物催化合成7-磷酸有效胺。 BLAST分析表明ValB是ADP轉移酶，本研究中以化學合成的不同底物做酶活分析。結果表明ValB以ATP為核苷供體，負責催化1-磷酸

6、有效烯醇生成ADP-有效烯醇，所以1-磷酸有效烯醇和ADP-有效烯醇都是合成途徑中的中間產物。與ValB有60％同源性的來自阿卡波糖合成途徑的NTP轉移酶AcbR以ATP或者GTP作為核苷供體，也利用1-磷酸有效烯醇作為底物，生成ADP-有效烯醇或者GDP-有效烯醇。 在糖基轉移酶ValG的體外酶活實驗中發(fā)現(xiàn)它除了UDP-葡萄糖之外，還可以利用非天然的糖基供體UDP-半乳糖催化合成新的化合物4"-表井岡霉素A，該化合物具有一定的