纖維堆囊菌遺傳操作體系建立及其在埃博霉素生物合成改造中的應(yīng)用.pdf

1、粘細(xì)菌是革蘭氏陰性的滑動(dòng)細(xì)菌，它以復(fù)雜的多細(xì)胞社會(huì)學(xué)行為及產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)而著稱。至今研究者已經(jīng)從粘細(xì)菌次級(jí)代謝物中鑒定了100種以上的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)和500多種結(jié)構(gòu)衍生物，約占微生物來(lái)源活性物質(zhì)總數(shù)的3.5％。在粘細(xì)菌的研究中，急需適宜的遺傳操作工具。但是到目前為止，轉(zhuǎn)導(dǎo)和電穿孔方法只能在模式菌粘球菌中有效的應(yīng)用。在其他的粘細(xì)菌類群中，甚至是不同的種或菌株，遺傳操作都很難獲得結(jié)果或效率很低。 堆囊菌屬是粘細(xì)菌中唯一能夠降解纖

2、維素的生理類群，尤其令人感興趣的是該屬菌株能夠產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物。菌株次級(jí)代謝物產(chǎn)生率接近100％，而且在粘細(xì)菌共17個(gè)屬所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物種類中，堆囊菌屬的次級(jí)代謝產(chǎn)物可達(dá)到48.4％。菌株So0157-2是本實(shí)驗(yàn)室從鹽水湖岸邊土樣品中分離鑒定的一株纖維堆囊菌。實(shí)驗(yàn)室前期生物學(xué)活性分析結(jié)果證實(shí)So0157-2可以產(chǎn)生包括埃博霉素(epothilones)在內(nèi)的多種生物活性物質(zhì)，是重要的藥源菌。 從天然藥物的結(jié)構(gòu)出發(fā)，進(jìn)行

3、結(jié)構(gòu)修飾、類似物的合成及系統(tǒng)的活性研究，以作為設(shè)計(jì)新藥目標(biāo)化合物的基礎(chǔ)，是國(guó)際上研究天然活性成分的主要思路和方法。埃博霉素作為極具潛力的抗癌藥物，其分子結(jié)構(gòu)與生物合成特點(diǎn)激發(fā)了科研人員和制藥公司的極大熱情，并已經(jīng)成為化學(xué)界、生物界和臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。埃博霉素屬于聚酮類化合物，由大型多酶復(fù)合體催化羧酸單體連續(xù)縮合而形成，該酶復(fù)合體稱為聚酮合酶即PKSs(Polyketide synthases)。模塊PKSs是聚酮合酶家族中的獨(dú)特類群，

4、表現(xiàn)出極其豐富的結(jié)構(gòu)和功能，該類模塊PKS的邏輯組織結(jié)構(gòu)形式，為人工創(chuàng)造各種非天然“天然”化合物提供了靈感，是組合生物合成的良好模式材料。 作為粘細(xì)菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物中最具有應(yīng)用前景的埃博霉素，其組合生物學(xué)改造的重要前提之一是建立良好的遺傳操作手段。目前，纖維堆囊菌中主要的遺傳操作方法是接合轉(zhuǎn)移，該方法在1992年由Jaoua S等人建立。隨著纖維堆囊菌次級(jí)代謝研究的展開，研究人員發(fā)現(xiàn)由于不同的纖維堆囊菌菌株生理生化性能存在顯

5、著差異，已建立的遺傳操作系統(tǒng)缺乏通用性，如在纖維堆囊菌So ce26或So ce56菌株中建立的遺傳操作系統(tǒng)并不能有效地應(yīng)用于纖維堆囊菌的其它菌株。而且，遺憾的是文獻(xiàn)所報(bào)道的接合轉(zhuǎn)移方法同樣不適用于本實(shí)驗(yàn)室分離的埃博霉素產(chǎn)生菌株So01 57-2的遺傳操作。所以，纖維堆囊菌遺傳操作手段的匱乏極大地阻礙了埃博霉素以及其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究。為了避開纖維堆囊菌難于操作的問題，研究者將目光轉(zhuǎn)到了發(fā)酵友好的異源宿主中，然而異源表達(dá)面臨的難題是：

6、epothilones對(duì)于非纖維堆囊菌宿主具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒活性，而epothilones的抗性機(jī)理尚不明確，使得異源表達(dá)產(chǎn)量較低，給后續(xù)的產(chǎn)物分析及工業(yè)化制備帶來(lái)很多困難。纖維堆囊菌So0157-2是一株具有優(yōu)良發(fā)酵性狀的埃博霉素產(chǎn)生菌，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。為了實(shí)現(xiàn)埃博霉素在產(chǎn)生菌中的定向結(jié)構(gòu)改造及代謝調(diào)控改造，探索和建立其高效的遺傳操作方法勢(shì)在必行。因此本論文從接合轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化兩個(gè)方面對(duì)纖維堆囊菌的遺傳體系進(jìn)行了研究。在建立起高效廣

7、泛適用于不同纖維堆囊菌的抗生素添加接合轉(zhuǎn)移方法的同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)纖維堆囊菌子實(shí)體形成過程中存在自然轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。利用本文所建立的抗生素添加的接合轉(zhuǎn)移方法，在epothilones產(chǎn)生菌So0157-2中進(jìn)行了epothilone的定向改造及代謝調(diào)控改造，并檢測(cè)到了epothilones結(jié)構(gòu)類似物的合成。論文的相關(guān)工作為進(jìn)行纖維堆囊菌的組合生物合成建立了技術(shù)平臺(tái)，希望產(chǎn)生大量的新化合物，豐富藥物篩選原料庫(kù)。此外，本論文還在纖維堆囊菌中發(fā)現(xiàn)了自然

8、轉(zhuǎn)化并對(duì)其實(shí)現(xiàn)條件進(jìn)行了初步探索，相關(guān)結(jié)果為纖維堆囊菌遺傳操作提供了新的思路。 實(shí)驗(yàn)通過在氯霉素抗性基因cat前端加入纖維堆囊菌能夠識(shí)別的啟動(dòng)子aphII，構(gòu)建了氯霉素抗性基因盒，然后將其插入誘動(dòng)載體pCVD442中，解決了纖維堆囊菌So0157-2接合轉(zhuǎn)移中無(wú)可用篩選抗生素的問題。這是首次將抗性基因序列短、不易產(chǎn)生耐藥性的氯霉素引入到纖維堆囊菌的遺傳操作系統(tǒng)中，使氯霉素繼腐草霉素與潮霉素后成為第三個(gè)纖維堆囊菌遺傳操作篩選標(biāo)記。

9、 通過對(duì)纖維堆囊菌接合轉(zhuǎn)移條件的摸索，最終確定了低劑量雙篩選抗生素添加的接合轉(zhuǎn)移方法。該方法與現(xiàn)有的纖維堆囊菌So ce56遺傳操作方法相比，接合轉(zhuǎn)移效率提高了10倍以上，陽(yáng)性率幾乎達(dá)到100％。并且對(duì)于So0157-2等難于操作的纖維堆囊菌來(lái)說(shuō)，抗生素添加的接合轉(zhuǎn)移方法使其遺傳操作的效率提高了100倍以上，為次級(jí)代謝改造在纖維堆囊菌中的直接進(jìn)行鋪平了道路。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，該方法不僅在纖維堆囊菌中具有廣泛的適用性，并且對(duì)大腸桿菌

10、的接合轉(zhuǎn)移同樣具有促進(jìn)作用。 通過質(zhì)粒的連續(xù)添加實(shí)驗(yàn)，首次實(shí)現(xiàn)了纖維堆囊菌So0003-3的自然轉(zhuǎn)化，而且基本確定了自然感受態(tài)出現(xiàn)的時(shí)間階段，即子實(shí)體形成的早期。實(shí)驗(yàn)還確定了CaCl2對(duì)感受態(tài)的形成有較好的促進(jìn)作用，并發(fā)現(xiàn)纖維堆囊菌對(duì)外界DNA的吸收重組可能具有序列識(shí)別能力。通過自然轉(zhuǎn)化的方法將含有埃博酶素epoF基因片段的質(zhì)粒pCCK700轉(zhuǎn)入纖維堆囊菌So0003-3中，并對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了驗(yàn)證。此外，通過纖維堆囊菌So0003

11、-3對(duì)外源DNA的吸附及降解情況以及子實(shí)體形成中釋放出大量DNA的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，證明了在自然環(huán)境中纖維堆囊菌發(fā)生自然轉(zhuǎn)化的可能性。目前，纖維堆囊菌轉(zhuǎn)化的研究還處于起步的階段，隨著研究的深入該方法極有可能成為纖維堆囊菌遺傳操作又一有力工具。與此同時(shí)，自然轉(zhuǎn)化在粘細(xì)菌中的發(fā)現(xiàn)還為其如此龐大的基因組可能是通過基因水平轉(zhuǎn)移進(jìn)化而來(lái)提供了實(shí)驗(yàn)支持。以本論文所建立的抗生素添加的纖維堆囊菌高效接合轉(zhuǎn)移體系為基礎(chǔ)，利用聚酮合酶的模塊特性，設(shè)計(jì)了單一結(jié)構(gòu)域失

12、活以及模塊缺失的結(jié)構(gòu)改造路線。實(shí)現(xiàn)了基因epoD中模塊7的結(jié)構(gòu)域失活，并將epoE中的TE結(jié)構(gòu)域提前到了epoD中，對(duì)埃博霉素的合成進(jìn)行了提前終止，并對(duì)所獲得的突變株進(jìn)了產(chǎn)物分析。目前尚未見對(duì)埃博霉素合成酶基因簇中這兩個(gè)模塊進(jìn)行研究的報(bào)道。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，模塊7中KR結(jié)構(gòu)域是沒有功能的，這與氨基酸序列以及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果相吻合；模塊7中MT結(jié)構(gòu)域的失活使產(chǎn)物epthiloneA1、A2的發(fā)酵量有所提高。另外，TE結(jié)構(gòu)域提前使埃博霉素

13、合成提前終止，但其產(chǎn)物的鑒定仍需要更多的結(jié)構(gòu)化學(xué)分析。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容對(duì)埃博霉素定向改造進(jìn)行了初步探索，相關(guān)結(jié)果可以為篩選新的埃博霉素類似物提供備選化合物，并為聚酮類化合物的組合生物合成奠定基礎(chǔ)和提供理論指導(dǎo)。 纖維堆囊菌所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物中，聚酮類化合物是主要的產(chǎn)物，其合成酶基因通常表現(xiàn)出獨(dú)特的序列組成和組織結(jié)構(gòu)的多樣性。美國(guó)基因組學(xué)研究所(TIGR)對(duì)粘細(xì)菌DK1622的全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，PKSs基因約占其基因組的8.6

14、％，因此在堆囊菌中仍可能有大量的次級(jí)代謝物有待我們?nèi)パ芯俊?shí)驗(yàn)室的前期工作從So0157-2的cosmid粘粒文庫(kù)中篩選到了一個(gè)非埃博霉素聚酮合酶基因，該聚酮合酶與埃博霉素合酶的組織結(jié)構(gòu)有一定的相似性。本論文對(duì)該粘粒cosmid6進(jìn)行了測(cè)序，共獲得了31777 bp的序列，其中包括一個(gè)完整的新的聚酮合酶基因dx1，全長(zhǎng)14673 bp，初步判斷其含有3個(gè)模塊。還獲得了dx1下游部分dx2基因。對(duì)dx1、dx2基因進(jìn)行了結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)，證實(shí)

15、該聚酮合酶為一類結(jié)構(gòu)較為新穎的聚酮合酶基因簇--反式AT型模塊PKS。同時(shí)確定了該基因簇中沒有NRPS模塊的存在，對(duì)前期的cosmid6所含聚酮合酶的特征預(yù)測(cè)進(jìn)行了修正。使用本論文所建立的抗生素添加的接合轉(zhuǎn)移方法對(duì)野生型纖維堆囊菌So0157-2的dx1基因進(jìn)行了插入失活。對(duì)突變子的產(chǎn)物分析表明，埃博霉素產(chǎn)量明顯提高。相關(guān)研究不僅可以幫助我們認(rèn)識(shí)纖維堆囊菌So0157-2中聚酮合酶的多樣性和特殊性，認(rèn)識(shí)纖維堆囊菌聚酮類化合物合成酶基因的