高產(chǎn)埃博霉素纖維堆囊菌的genome shuffling選育研究.pdf

1、埃博霉素(epothilone)是纖維堆囊菌產(chǎn)生的一類具有抗腫瘤活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物。與傳統(tǒng)的抗癌藥物紫杉醇相比,埃博霉素能夠更好地抑制腫瘤細(xì)胞增殖,且分子結(jié)構(gòu)簡單、水溶性好、毒副作用小、抗腫瘤譜廣、可發(fā)酵生產(chǎn),是一種具有重要開發(fā)潛力的新型抗腫瘤活性物質(zhì)。然而,由于人們對纖維堆囊菌的遺傳背景認(rèn)知不足、遺傳操作系統(tǒng)低效及缺乏有效的遺傳標(biāo)記等問題,針對纖維堆囊菌的遺傳改造及埃博霉素的異源表達(dá)都遇到了極大的困難,因此采用常規(guī)手段對其進(jìn)行菌種

2、選育仍是目前提高埃博霉素產(chǎn)量的主要方法。
　　Genome shuffling是近年來提出的一種簡便、高效的菌種改良方法,以多輪遞歸原生質(zhì)體融合為依托,將不同親本的優(yōu)良性狀高效地整合到融合子中,借助高通量篩選方法可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得性狀顯著改良的突變株,目前已在多種工業(yè)菌株的選育中得到了證實(shí)。本文從纖維堆囊菌野生菌株So0157-2出發(fā),通過pH、前體及產(chǎn)物耐受選育、分散生長馴化和genome shuffling選育技術(shù),結(jié)合適當(dāng)

3、的高通量篩選方法對大量菌株進(jìn)行了篩選,得到了埃博霉素產(chǎn)量顯著提高的菌株。
　　主要工作如下:
　　1、通過對野生菌株的pH耐受選育和基于前體、產(chǎn)物兩步推理選育獲得高產(chǎn)型菌株P(guān)e107,其埃博霉素A、B產(chǎn)量分別提高至出發(fā)菌株的227.0％和210.3％,且基本保留了耐受pH和高濃度前體、產(chǎn)物的優(yōu)良性狀。
　　2、由于纖維堆囊菌在液體培養(yǎng)時(shí)具有聚團(tuán)生長的特征,不利于發(fā)酵,本文通過對具有分散生長趨勢的pH耐受突變株進(jìn)行上清傳

4、代馴化,獲得分散生長型菌株L4-29。雖然發(fā)酵過程其菌體總量和產(chǎn)量明顯降低,但其液體種子菌液幾乎為渾濁均一的液體,分散度約為野生菌株的10倍。
　　3、隨后探索了纖維堆囊菌原生質(zhì)體的制備、再生、滅活以及融合條件。確定制備條件為種齡3天,PBS洗滌2次,終濃度14％的甘露醇為高滲液,15％EDTA預(yù)處理30min后添加3g·L-1溶菌酶酶解90min;再生條件為高滲液洗滌殘留酶液3次,然后以含10％高滲成分的M26液體培養(yǎng)基復(fù)壯24

5、h,再用含10％高滲成分的0.25％水瓊脂懸浮菌體后傾倒于VY/2再生固體培養(yǎng)基上層;滅活條件為距離30W紫外燈5cm處紫外照射滅活分散生長型親本4min,55℃水浴熱滅活高產(chǎn)型親本10min;融合條件為添加30％PEG、30℃水浴融合6min。
　　4、采用上述原生質(zhì)體融合條件,以高產(chǎn)型菌株P(guān)e107和分散生長型菌株L4-29為親本進(jìn)行g(shù)enome shuffling選育。獲得高產(chǎn)型融合菌株Gc16,其埃博霉素A、埃博霉素B產(chǎn)量

6、分別提高至高產(chǎn)型親本的117.9％和117.1％,且為野生菌株的267.6％和246.2％。
　　5、分析了96孔板微培養(yǎng)和微板光譜儀分析相結(jié)合的埃博霉素B高產(chǎn)菌株快速篩選方法的可行性。待測菌株采用96孔板微量固體發(fā)酵,四氯化碳浸提發(fā)酵產(chǎn)物,經(jīng)微板光譜儀測定OD249、HPLC產(chǎn)量檢測結(jié)合SPSS軟件分析,埃博霉素B含量與OD249具有較好的相關(guān)性,OD249數(shù)值位于前20％的菌株可用于復(fù)篩。樣品浸提液中埃博霉素B含量及OD249