埃博霉素生產(chǎn)菌株選育及埃博霉素抑瘤活性研究.pdf

1、粘細(xì)菌是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它具有復(fù)雜的多細(xì)胞行為，纖維堆囊菌是粘細(xì)菌中能夠降解纖維素的類群之一。纖維堆囊菌能夠產(chǎn)生多種抗真菌、抗細(xì)菌和抗腫瘤作用的生物活性物質(zhì)，其中，通過穩(wěn)定微管來抑制腫瘤細(xì)胞生長的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素埃博霉素尤為引人注目。到目前為止，埃博霉素類藥物已成功上市，在抗擊腫瘤細(xì)胞中起到十分重要的作用。然而，埃博霉素的生產(chǎn)主要依賴于化學(xué)合成法，相比之下，微生物生產(chǎn)法卻并未廣泛應(yīng)用，主要限制是由于其產(chǎn)生菌纖維堆囊菌發(fā)酵產(chǎn)量水平較低

2、，選育高產(chǎn)纖維堆囊菌來提高埃博霉素產(chǎn)量具有工業(yè)指導(dǎo)意義。
　　 本文對纖維堆囊菌So 0157-2進(jìn)行了高效的菌株選育，篩選到了埃博霉素A、B產(chǎn)量均有大幅度提高的突變株LG3111776，其高產(chǎn)菌株埃博霉素A、B產(chǎn)量分別為出發(fā)菌株的5倍和3倍左右。接下來，我們又對埃博霉素抗腫瘤機(jī)理進(jìn)行了深入的分析，闡述了埃博霉素A、B混合制劑之間的協(xié)同作用以及埃博霉素對凋亡、自噬的作用現(xiàn)象進(jìn)行了說明。
　　 在菌株選育中，文中以纖維堆囊

3、菌So 0157-2作為出發(fā)菌株，引進(jìn)pH極端環(huán)境脅迫選育法對出發(fā)菌株進(jìn)行馴化，富集優(yōu)勢菌株，并對四株耐受菌株通過高效液相色譜法檢測其發(fā)酵液中埃博霉素A、B，以埃博霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行擬合分析其產(chǎn)量變化，篩選產(chǎn)量提高的優(yōu)勢菌株LG31。LG31再次作為出發(fā)菌株，利用傳統(tǒng)的紫外誘變和硫酸二乙酯誘變，結(jié)合96孔板高通量篩選法初篩、高效液相色譜法驗(yàn)證，進(jìn)一步篩選出了突變株LG31-11-7。隨后，菌株LG31-11-7采用紫外誘變與推理選育相結(jié)合

4、的方法，分別以耐受高濃度前體乙酸鈉和耐受高濃度終產(chǎn)物兩個(gè)角度進(jìn)行了高效的選育工作，并配合生物指示法和TLC薄層層析法快速篩選正突變株，得到了最終的高產(chǎn)菌株LG3111776。對高產(chǎn)菌株LG3111776進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化，使埃博霉素產(chǎn)量穩(wěn)定提高，最終穩(wěn)定在43.1 mg/L和22.9 mg/L左右，較初始菌株產(chǎn)量提高了5倍多和3倍多。不但為原生質(zhì)體融合提供了菌株多樣性的親本，并且為工業(yè)生產(chǎn)提高了良好的菌株資源。
　　 當(dāng)埃博霉素

5、作用于多株腫瘤細(xì)胞系時(shí)，埃博霉素表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性。其中，PC3、HELA、KB、K562、MCF-7、U87對埃博霉素最為敏感，并且埃博霉素A、B混合制劑作用后，發(fā)現(xiàn)了獨(dú)特的協(xié)同效應(yīng)。通過細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及Xcelligence監(jiān)控細(xì)胞生長三種方法進(jìn)一步驗(yàn)證了這種協(xié)同效應(yīng)。我們推斷這種協(xié)同效應(yīng)出現(xiàn)的可能原因是埃博霉素A、B之間的競爭作用以及埃博霉素與腫瘤細(xì)胞表面蛋白之間離子電荷吸引作用力達(dá)到不同程度的飽和而引起的。另外，當(dāng)埃

6、博霉素A、B作用于U87/LC3腫瘤細(xì)胞時(shí)，熒光顯微鏡的觀察顯示埃博霉素能夠引起LC3蛋白（微管相關(guān)蛋白）點(diǎn)聚狀典型性變化，說明埃博霉素可以誘導(dǎo)U87細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象，而自噬現(xiàn)象是細(xì)胞程序性死亡的途徑之一。通過對U87細(xì)胞LC3蛋白進(jìn)行GFP熒光轉(zhuǎn)染標(biāo)記，我們可以清晰的觀察到由于自噬現(xiàn)象而引起細(xì)胞質(zhì)中的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。DAPI染色細(xì)胞核的變化過程則從另一方面說明了埃博霉素在誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡和自噬的之間具有一定依賴作用，這將有助于對埃博霉素藥