纖維堆囊菌So0157-2埃博霉素合成相關(guān)調(diào)控蛋白的分離和鑒定.pdf

1、粘細(xì)菌纖維堆囊菌（Sorangium cellulosum）是抗腫瘤藥物埃博霉素的產(chǎn)生菌，埃博霉素具有和紫杉醇類似的抗腫瘤活性，并且具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單，水溶性好，毒副作用小，不易誘發(fā)耐藥性等諸多優(yōu)于紫杉醇的優(yōu)點(diǎn)，尤其對(duì)紫杉醇類耐藥的腫瘤細(xì)胞具有較高活性，使其具有巨大的藥用價(jià)值。但其合成技術(shù)上的瓶頸嚴(yán)重制約了該類藥物的研發(fā);遺傳操作手段的缺乏，則進(jìn)一步限制了埃博霉素生物合成調(diào)控及遺傳改造的研究。為了從根本上了解埃博霉素的調(diào)控機(jī)制，提高

2、埃博霉素的產(chǎn)量，我們進(jìn)行了纖維堆囊菌So0157-2埃博霉素合成相關(guān)的調(diào)控蛋白進(jìn)行了分離和鑒定。
　　 我們通過生物素同鏈霉親和素相互作用的磁珠，利用埃博霉素合成基因簇上游的非編碼區(qū)對(duì)不同培養(yǎng)條件下的So0157-2埃博霉素調(diào)控蛋白進(jìn)行釣取。選擇埃博霉素產(chǎn)量有明顯差異的合成培養(yǎng)基和M26培養(yǎng)基對(duì)埃博霉素調(diào)控蛋白進(jìn)行DNA pull-down實(shí)驗(yàn)。為了獲得盡可能多的調(diào)控因子，選擇埃博霉素合成基因簇與上游可預(yù)測的編碼基因之間的133

3、2 bp的序列作為pull-down的誘餌。獲得的兩種培養(yǎng)條件下的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，將合成培養(yǎng)條件下和M26培養(yǎng)條件下的差異蛋白進(jìn)行shot-gun質(zhì)譜檢測。檢測結(jié)果同So ce56數(shù)據(jù)庫比對(duì)獲得16個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，同So0157-2數(shù)據(jù)庫比對(duì)獲得5個(gè)So0157-2特有的調(diào)控因子，經(jīng)過生物信息學(xué)分析后從中選擇了三個(gè)蛋白命名為Etf1、Etf2、Etf3。分別對(duì)Etf1、Etf2、Etf3構(gòu)建表達(dá)載體，異源表達(dá)并純化獲得Et

4、f1、Etf2、Etf3純蛋白，利用EMSA對(duì)這三個(gè)蛋白進(jìn)行體外結(jié)合活性的驗(yàn)證。纖維堆囊菌So0157-2的遺傳操作體系尚不完善造成了我們對(duì)于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子體內(nèi)調(diào)控作用進(jìn)行深入探索的困難，因此我們將調(diào)控序列和調(diào)控蛋白分別克隆到兩個(gè)質(zhì)粒上。其中So0157-2埃博霉素合成基因簇上游調(diào)控序列USE(upstream sequence of epothilone biosynthetic gene clusters,1332 bp)、CUSE(

5、conserved USE,425 bp)、PUSE(putative USE，158 bp)連上綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因后克隆入pET-28a載體中，新構(gòu)建的質(zhì)粒分別編號(hào)為pWLUSE01、pWLUSE02、pWLUSE03;將調(diào)控蛋白Etf1、Etf2和Etf3基因克隆入pBAD33，置于阿拉伯糖啟動(dòng)子下，分別編號(hào)為pWLETF01、 pWLETF02、pWL

6、ETF03。將構(gòu)建好的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到E.coli Top10F'感受態(tài)細(xì)胞中。
　　 Etf1能同埃博霉素合成基因簇上游調(diào)控序列1332 bp全長USE(upstream sequence of epothilone biosynthetic gene clusters)、CUSE(conserved USE)結(jié)合形成清晰的阻滯條帶，證實(shí)Etf1可以和USE、CUSE結(jié)合，在加入了非特異競爭性DNA PolydIdC后仍然有阻滯現(xiàn)

7、象，證實(shí)Etf1的結(jié)合是特異的，并且Etf1的結(jié)合受鹽離子濃度的影響不大，Etf2、Etf3的結(jié)合微弱阻滯現(xiàn)象不明顯。為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子在體內(nèi)的調(diào)控作用，我們建立了異源體內(nèi)結(jié)合體系，以Etf1為例進(jìn)行了驗(yàn)證。首先采用RT-PCR方法對(duì)Etf1的表達(dá)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄分析，驗(yàn)證Etf1基因的轉(zhuǎn)錄，接著采用Westernblot證實(shí)了Etf1的表達(dá)。利用分光光度計(jì)對(duì)pWLETF01同pWLUSE01、pWLUSE02、pWLUSE03共轉(zhuǎn)化的菌

8、體在誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)條件下的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示pWLETF01同pWLUSE01、pWLUSE02共轉(zhuǎn)化的菌體在未誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)條件下均能檢測到熒光信號(hào)。前者熒光強(qiáng)度隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增強(qiáng);后者在添加了誘導(dǎo)劑阿拉伯糖后，熒光強(qiáng)度就不再隨時(shí)間的增加而增強(qiáng)。pWLETF01同pWLUSE03共轉(zhuǎn)化的菌體在誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)條件下均未檢測到熒光信號(hào)，由此此可知埃博霉素合成基因簇上游調(diào)控序列USE、CUSE可以被大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)識(shí)別并啟動(dòng)下游報(bào)告