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文檔簡介
1、纖維素降解菌類的分離與鑒定系列實(shí)驗(yàn) 纖維素降解菌類的分離與鑒定系列實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)背景 一、實(shí)驗(yàn)背景纖維素是植物細(xì)胞壁主要成分,屬于多糖類物質(zhì),是地球上數(shù)量最大的可再生資源。如能利用微生物將其轉(zhuǎn)化為生物產(chǎn)品或生物能源,即可緩解能源短缺、解決環(huán)境污染,又能形成新的產(chǎn)業(yè)。由于在自然界中存在著大量產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌和真菌,因而纖維素的生物降解主要依賴于微生物的作用。從 20 世紀(jì)40-50 年代起,針對(duì)產(chǎn)纖維素酶的微生物的分離篩選就進(jìn)行了大量的工作
2、,并逐步建立起一套較完整的分離篩選方法。迄今為止有關(guān)纖維素降解菌分離篩選的研究報(bào)導(dǎo)已有很多,如細(xì)菌中的生孢噬纖維菌屬、噬纖維菌屬及纖維單胞菌屬等;放線菌由于能形成芽孢,與真菌相比較耐高溫和各種酸堿度,故在高溫階段放線菌對(duì)分解木質(zhì)素和纖維素起著重要的作用。主要有諾卡氏菌屬、鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬及小單胞菌屬等;真菌中研究較多的是青霉屬、根霉屬、曲霉屬等,其中以木霉屬的菌株纖維素酶活較高。以羧甲基纖維素鈉和添加少量葡萄糖作為碳源,培養(yǎng)纖維素酶
3、產(chǎn)生菌株,培養(yǎng)一定時(shí)間后,經(jīng)剛果紅染色和稀堿液固定,在菌落周圍形成透明水解圈,根據(jù)透明圈的大小,快速定性鑒定纖維素酶產(chǎn)生菌酶活大小。與傳統(tǒng)纖維素酶活檢測(cè)方法比較,本方法菌絲生長快,兩天后菌落經(jīng)染色,透明圈邊緣清晰,直觀性強(qiáng),與酶活力成一定線性關(guān)系。纖維素是世界上所有植物的組成部分,是地球上最為豐富且可再生的資源。隨著世界能源形勢(shì)趨于惡化,環(huán)境問題日益加劇,利用纖維素生產(chǎn)有高附加值資源的以維持人類可持續(xù)發(fā)展的研究方向近年來逐步成為科學(xué)研究
4、的熱點(diǎn)方向。利用微生物將纖維素、半纖維素降解轉(zhuǎn)化為生物產(chǎn)品或生物能源即可緩解能源短缺、解決環(huán)境污染,又能形成新的產(chǎn)業(yè)。因此分離和篩選高酶活性的菌株是有效利用纖維素物質(zhì)的關(guān)鍵。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膹哪繕?biāo)試樣中分離篩選出具有降解纖維素能力的菌株。三、實(shí)驗(yàn)材料 三、實(shí)驗(yàn)材料:1、樣品的采集1)風(fēng)干土樣 E4-1、E2-6、 E2-6 試樣。2)潮濕土樣 E4-1、E2-6、 E2-6 試樣。(6)涂布平板:將稀釋度為 10-6 至 10
5、-8 懸液各取 0.08ml 涂布到平板培養(yǎng)基上,每個(gè)梯度需涂布 2 個(gè)平板,設(shè)為對(duì)照。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察,持續(xù)觀察,直到出現(xiàn)明顯的菌落。3、挑菌保種將出來的明顯菌類按照類別分別保種到不同的斜面培養(yǎng)基中。4、剛果紅鑒定配制剛果紅培養(yǎng)基,將菌株點(diǎn)樣與剛果紅培養(yǎng)基上,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。觀察各個(gè)菌株是否具有分解纖維素的能力。(從濕土中提取纖維素菌) (從濕土中提取纖維素菌)1、分別配制①羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基②LB 培養(yǎng)基③高氏一號(hào)培養(yǎng)基④PD
6、A 培養(yǎng)基各 500ml,裝進(jìn) 5 個(gè)瓶子中。在 14 根試管中分別加入 9ml 蒸餾水,并用試管塞塞緊。在兩個(gè)錐形瓶中分別加入 45ml 蒸餾水,并且放如玻璃球,用封口膜封好。包 90 個(gè)平板。準(zhǔn)備 1ml 和 0.1ml 移液槍的槍頭。將以上 5 種物品用報(bào)紙包好后放入滅菌鍋中 121℃滅菌 30 分鐘。同時(shí)將操作臺(tái)的紫外線打開。2、待滅菌完后,將物品取出,放入烘箱烘干。3、將烘干后的平板、試管、錐形瓶、槍頭放入操作臺(tái)里。兩種濕土樣
7、分別稱取5g,在操作臺(tái)里加到錐形瓶中,封口,放到搖床上搖 30 分鐘。4、搖好后取回,關(guān)閉操作臺(tái)的紫外線。取 7 支試管并分別標(biāo)號(hào)-2、-3、-4、-5、-6、-7,用 1ml 移液槍從一個(gè)錐形瓶中吸取 1ml 菌液,射到-2 號(hào)試管中,換槍頭,從-2 號(hào)試管中吸取 1ml 菌液射到-3 號(hào)試管中,以此類推。另一個(gè)錐形瓶的菌液也要經(jīng)過同樣的操作。5、取一個(gè)培養(yǎng)基(例如 LB 培養(yǎng)基) ,倒 24 個(gè)平板,立即用 1ml 移液槍移取一種菌
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