固氮菌和纖維素分解菌添加量對(duì)體外發(fā)酵的影響.pdf

1、瘤胃內(nèi)存在兼性厭氧纖維素分解菌和固氮菌已得到證明，但其作用研究鮮有報(bào)道。試驗(yàn)室前期體外培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，來(lái)自奶牛瘤胃的兼性厭氧固氮菌和纖維素分解菌按照1∶4的比例混合添加到瘤胃，能夠調(diào)節(jié)瘤胃的內(nèi)環(huán)境、并提高飼料的降解率。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)選擇從奶牛瘤胃內(nèi)分離出兼性厭氧纖維素分解菌和固氮菌為混合菌，通過(guò)體外發(fā)酵方法探究混合菌的適宜添加量，并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)添加混合菌后培養(yǎng)液中三種纖維素菌數(shù)量，從而揭示混合菌的可能作用機(jī)理。本試驗(yàn)

2、包括兼性厭氧纖維素分解菌和固氮菌的活化和體外發(fā)酵試驗(yàn)兩部分。
　　兼性厭氧纖維素分解菌和固氮菌的活化與計(jì)數(shù)
　　試驗(yàn)用的兼性厭氧纖維素分解菌和固氮菌由試驗(yàn)室前期分離得到，均來(lái)源于奶牛瘤胃內(nèi)容物，保存在-20℃（菌液與30％的甘油1∶1混合）。將菌株由冰箱取出，室溫條件下解凍，用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，而后轉(zhuǎn)接進(jìn)行再培養(yǎng)，直至培養(yǎng)液活菌數(shù)超過(guò)1×10H CFU/mL為止，菌的數(shù)量采用平板計(jì)數(shù)法確定。取出部分纖維素分解菌菌液，高

3、壓、121℃下滅活15分鐘，用于稀釋菌液。將菌液中的纖維素分解菌的活菌數(shù)稀釋至1.2×1010 CFU/mL、1.2×109CFU/mL、1.2×108 CFU/mL、1.2×107 CFU/mL、1.2×106 CFU/mL與0 CFU/mL。固氮菌也進(jìn)行相同的稀釋處理。然后，將兩種相同稀釋濃度菌液按照1∶4的比例進(jìn)行混合，制成混合菌液。
　　兼性厭氧纖維素分解菌和固氮菌添加量對(duì)瘤胃體外發(fā)酵的影響
　　體外發(fā)酵裝置主要由兩

4、部分組成，震蕩恒溫水浴和100 mL注射器（即發(fā)酵管）。試驗(yàn)共使用48個(gè)發(fā)酵管，分為兩組每組24個(gè)，編號(hào)第1組和第2組，第1組在12h，第2組在48 h取出。每組分為6個(gè)處理組，每個(gè)處理組做4個(gè)重復(fù)。每組中的6個(gè)處理組分別添加已制成的混合菌液1mL（即6個(gè)處理組添加量分別為4.0×107 CFU/L，4.0×108 CFU/L，4.0×109CFU/L，4.0×1010 CFU/L，4.0×1011 CFU/L與0 CFU/L）。待發(fā)酵

5、12h和48 h，測(cè)定兩組發(fā)酵液的pH值、NH3-N、MCP、VFA、甲烷的含量、干物質(zhì)降解率、纖維素酶活性（包括濾紙酶、CMC酶和β-葡萄糖苷酶）等指標(biāo);另外，取第2組的各發(fā)酵管中發(fā)酵液約4 mL保存在液氮中，用于測(cè)定添加混合菌后對(duì)三種纖維素分解菌（白色瘤胃球菌（ruminococcus albus）、黃化瘤胃球菌（ruminococcus flavefaciens）及產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌（fibrobacter succinogenes

6、））在瘤胃液中的數(shù)量的影響。
　　根據(jù)pH值、NH3-N等指標(biāo)可以得出纖維素分解菌與固氮菌混合菌的最適添加量。選取48 h的對(duì)照組，最適添加量組（即4×1010 CFU/L），以及4×108 CFU/L的發(fā)酵液，通過(guò)熒光定量PCR方法，測(cè)定添加活菌制劑后對(duì)三種纖維素分解菌在瘤胃液中的含量的影響。
　　試驗(yàn)結(jié)果表明:12h與48 h的各試驗(yàn)組的pH值均在最適pH值的范圍內(nèi)，而12h的各VFA與甲烷含量均低于對(duì)照組(P＜0.05

7、)，但是NH3-N、MCP、干物質(zhì)降解率、纖維素酶活性有所提高(P＜0.05)，尤其是試驗(yàn)組4.0×1010 CFU/L的NH3-N和MCP產(chǎn)量、干物質(zhì)降解率、濾紙酶活性明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。在48 h時(shí)，各組間的pH值均差異不顯著(P＞0.05)。試驗(yàn)組NH3-N、MCP、VFA、TVFA與甲烷的含量、干物質(zhì)降解率、纖維素酶活性有所提高，試驗(yàn)組4.0×1010 CFU/L乙酸、丙酸、甲烷、干物質(zhì)降解率、NH3-N、MCP含量

8、明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，丁酸含量雖與對(duì)照組差異不明顯但數(shù)值上略高于與對(duì)照組，然而此時(shí)纖維素酶含量4.0×1010 CFU/L組低于對(duì)照組。這些添加量中以4.0×1010 CFU/L效果最為明顯。
　　試驗(yàn)組4×1010 CFU/L組與對(duì)照組相比三種菌差異均顯著(P＜0.05)。試驗(yàn)組4×1010 CFU/L組白色瘤胃球菌明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，試驗(yàn)組4×108 CFU/L相對(duì)于對(duì)照組有下降的趨勢(shì)(P=0.0991)

9、，試驗(yàn)組4×1010 CFU/L組黃化瘤胃球菌明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，而試驗(yàn)組4×108 CFU/L組與對(duì)照組差異不明顯（P＞0.05），但是在數(shù)值上略高于對(duì)照組。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌，各組均有差異（P＜0.05），含量由高到低分別為4×1010 CFU/L組＞4×108 CFU/L組＞對(duì)照組。
　　綜合來(lái)看，從體外試驗(yàn)可以得出:添加固氮菌與纖維素分解菌組成的活菌制劑能夠調(diào)節(jié)瘤胃內(nèi)環(huán)境，最佳的添加量為4.0×1010 CFU/