奶牛瘤胃兼性厭氧纖維素分解細(xì)菌的分離鑒定及其產(chǎn)酶研究.pdf

1、我國(guó)具有豐富的秸稈資源，但用來(lái)做家畜飼料的僅占15％-20％，大部分秸稈被丟棄或燒掉，這是一種巨大的資源浪費(fèi)。同時(shí)，農(nóng)作物秸稈在作為粗飼料利用過(guò)程中還存在著營(yíng)養(yǎng)缺陷：家畜采食量低，體內(nèi)消化率低，養(yǎng)分不平衡(低N、低Ca、低P、低葡萄糖物質(zhì))，導(dǎo)致我國(guó)奶牛單產(chǎn)水平低，淘汰率高，制約了我國(guó)奶牛養(yǎng)殖效益提高。 運(yùn)用微生物發(fā)酵技術(shù)處理秸稈，提高粗飼料中的蛋白質(zhì)和碳水化合物含量，被認(rèn)為是解決上述問題的有效方法。研究人員利用纖維素分解菌及其

2、復(fù)合菌制劑發(fā)酵秸稈，發(fā)現(xiàn)能夠降低秸稈中的纖維素含量而提高蛋白質(zhì)和碳水合物含量。奶牛瘤胃中存在大量的能夠分解纖維素的微生物，其中嚴(yán)格厭氧的纖維素分解菌在國(guó)外得到了深入的研究，但兼性厭氧的纖維素分解菌的研究還很少。由于兼性厭氧細(xì)菌能夠適應(yīng)飼料微貯過(guò)程中初始階段有氧，后期無(wú)氧的環(huán)境，因此兼性厭氧纖維素分解菌作為粗飼料添加劑更具有優(yōu)勢(shì)。 本研究的目的是從奶牛瘤胃液中分離出具有分解纖維素能力的兼性厭氧細(xì)菌，用于綠色粗飼料微生物添加劑研制。

3、研究分為兩個(gè)部分：第一部分奶牛瘤胃兼性厭氧纖維素分解菌的分離鑒定從奶牛瘤胃中采取瘤胃液，接種羧甲基纖維素鈉平板，采用嚴(yán)格厭氧結(jié)合需氧培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)剛果紅染色，篩選出分解纖維素能力強(qiáng)的兼性厭氧細(xì)菌。采用生化試驗(yàn)結(jié)合16SrDNA序列分析方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。同時(shí)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)特性及有無(wú)致病性進(jìn)行初步測(cè)定。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共分離到63株具有分解纖維素能力的細(xì)菌，其中29株有較強(qiáng)的分解纖維能力。24株G-細(xì)菌經(jīng)生化鑒定

4、結(jié)合16SrDNA序列分析，18株為肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種，3株為銅綠假單胞桿菌，2株為大腸桿菌，1株為產(chǎn)酸克雷伯氏菌。5株G+細(xì)菌經(jīng)16SrDNA序列分析，2株與蘇云金芽孢桿菌有99.7％同源性，2株與巨大芽孢桿菌有99.6％同源性，1株與蠟狀芽孢桿菌有99.5％的同源性。分類學(xué)上可分別歸于蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌。細(xì)菌的生長(zhǎng)特性及致病性試驗(yàn)表明，分離到的細(xì)菌在20-41℃，pH5-9之間生長(zhǎng)良好，肺炎克雷伯氏菌、蘇

5、云金芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌無(wú)致病性。 第二部分肺炎克雷伯氏菌和蘇云金芽孢桿菌的產(chǎn)纖維素酶研究選取一株G-細(xì)菌(2＃，肺炎克雷伯氏菌)和一株G+細(xì)菌(9＃，蘇云金芽孢桿菌)進(jìn)行產(chǎn)酶研究。為了確定細(xì)菌的產(chǎn)酶方式，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行了超聲波破碎，測(cè)定破碎前后酶活力有無(wú)顯著差異。為了檢測(cè)細(xì)菌的產(chǎn)酶種類，進(jìn)行了濾紙酶活力、C1酶活力、β-葡萄糖苷酶活力和CX酶活力測(cè)定。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選取的G-和G+細(xì)菌產(chǎn)酶情況基本類似。細(xì)菌菌液離心后上清液

6、中有較高的濾紙酶活力、β-葡萄糖苷酶活力和CX酶活力，而C1酶活力很低，并且未經(jīng)破碎的菌液和經(jīng)過(guò)破碎的菌液離心上清液中酶活力并無(wú)明顯差異。說(shuō)明細(xì)菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶和內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶，并且為胞外酶。 細(xì)菌菌體有較高的C1酶活力，而上清中C1酶活力很低，且經(jīng)破碎和未經(jīng)破碎菌體酶活力無(wú)明顯差異，說(shuō)明細(xì)菌能產(chǎn)外切-β-1,4-葡聚糖酶。但這種酶游離性比較差，可能粘附在細(xì)胞膜或細(xì)胞壁上。 研究表明：細(xì)菌能夠產(chǎn)生內(nèi)切-β-