兼性厭氧產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選及其發(fā)酵豆粕工藝研究.pdf

1、本論文以兼性厭氧、產(chǎn)蛋白酶為條件,篩選發(fā)酵豆粕優(yōu)良菌種;對篩選菌株進(jìn)行毒理性實(shí)驗(yàn)和蛋白酶相對酶活力的測定,并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室保藏的植物乳桿菌 NCU116對豆粕發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行研究,跟蹤分析發(fā)酵過程,確定最佳發(fā)酵工藝條件。
　　本文的主要研究內(nèi)容與結(jié)論如下:
　　(1)優(yōu)良發(fā)酵豆粕菌種的篩選與鑒定。在發(fā)酵豆粕、自然發(fā)酵的豆豉中篩選得到1株兼性厭氧、產(chǎn)蛋白酶菌株。經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),確定其為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌,并命名為 NC

2、U507。
　　(2)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌 NCU507(Bacillus methylotrophicus NCU507)的毒理性研究。首先對甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌 NCU507生長曲線的進(jìn)行測定,0~8 h, NCU507菌數(shù)迅速增加至9.1×107 cfu/mL(7.96 logCFU/mL);8 h~20 h,菌數(shù)緩慢增加,在20 h時(shí)達(dá)到最大,為4.8×108 cfu/mL(8.68 logCFU/mL);之后,菌數(shù)緩慢減少,

3、40 h時(shí)減少至1.8×107 cfu/mL(7.26 logCFU/mL)。然后,測定 NCU507的細(xì)胞毒性,發(fā)現(xiàn)其在106 cfu/mL和107 cfu/mL時(shí)的加入量不會(huì)引起 Caco-2細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞,無細(xì)胞毒性。
　　(3)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌 NCU507(Bacillus methylotrophicus NCU507)的酶學(xué)性質(zhì)研究。在不同的溫度、pH、保溫時(shí)間等因素的限制下測定蛋白酶的相對酶活力。結(jié)果表明,在4

4、0℃、pH為7.0時(shí)相對酶活力和酶的穩(wěn)定性最高,Mn2+對酶反應(yīng)促進(jìn)作用最為明顯。
　　(4)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌 NCU507(Bacillus methylotrophicus NCU507)單菌發(fā)酵豆粕工藝研究。單因素實(shí)驗(yàn)表明最佳發(fā)酵時(shí)間為96 h、最佳發(fā)酵溫度為37℃、最佳接種量為4％、最佳料水比為1:1。.響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果表明最佳發(fā)酵溫度36.8℃,最佳料水比為1:1.2,最佳發(fā)酵時(shí)間為85 h;在此條件下,理論可預(yù)測的

5、水解度為26.24%。根據(jù)理論預(yù)測條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示其水解度為26.13%,與預(yù)測值接近,表明實(shí)驗(yàn)優(yōu)化所得工藝條件可靠。
　　對單菌發(fā)酵豆粕過程動(dòng)態(tài)分析,在前48 h內(nèi),菌數(shù)維持在大約8.85 log CFU/g;隨著時(shí)間的增加,甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌 NCU507的菌數(shù)逐漸下降。終點(diǎn)96 h時(shí),下降至6.66 logCFU/g?？偟鞍椎暮恐饾u上升。0 h時(shí),初始總蛋白含量為47.68%(w/w),終點(diǎn)96 h時(shí),總蛋白含量

6、增加至52.90%(w/w)。小肽含量持續(xù)增加。在0 h~36 h內(nèi),小肽的含量迅速增加,由0.30%增加至21.40%(w/w),之后在36 h~96 h內(nèi),小肽的含量緩慢增加,終點(diǎn)96 h時(shí),達(dá)到28.13%(w/w)。有機(jī)酸含量呈逐漸減少趨勢,在0 h~24 h內(nèi),有機(jī)酸含量維持在0.49%(w/w),接著在24 h~72 h內(nèi)迅速下降,在72 h時(shí),有機(jī)酸含量降至0.15%(w/w);在72 h~96 h內(nèi),有機(jī)酸含量持續(xù)下降并

7、逐漸降低至0%(w/w)。
　　(5)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌 NCU507(Bacillus methylotrophicus NCU507)與植物乳桿菌 NCU116混菌固態(tài)發(fā)酵豆粕工藝研究。單因素實(shí)驗(yàn)表明,NCU116與NCU507最佳接種比例為1:4、最佳總接種量為9%、最佳發(fā)酵時(shí)間為96 h、最佳料水比比例為1:1。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果表明,最佳接種比例為5:1、最佳總接種量為7.50%、最佳料水比為1:1.2。此優(yōu)化結(jié)果,理論可預(yù)

8、測的水解度為26.52%。根據(jù)理論預(yù)測條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示其水解度的為26.37%,與預(yù)測值接近,表明實(shí)驗(yàn)優(yōu)化所得工藝條件可靠。
　　對混菌發(fā)酵豆粕過程動(dòng)態(tài)分析,植物乳桿菌 NCU116的加入使得甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌 NCU507菌數(shù)的穩(wěn)定期從48 h縮短為24 h,0 h~24 h時(shí),NCU507的菌數(shù)維持在9.58 log CFU/g左右,然后在24 h~96 h內(nèi),迅速下降至4.72 log CFU/g; NCU116的

9、菌數(shù)的穩(wěn)定期時(shí)間較長,在0 h~48 h時(shí)一直維持在8.83 log CFU/g,然后在48 h~96 h內(nèi),下降至6.00 log CFU/g?？偟鞍缀恐饾u上升,終點(diǎn)96 h時(shí),總蛋白含量為57.08%(w/w)。與單菌發(fā)酵相比,混菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)總蛋白含量上升了4.18%(w/w);小肽含量在整個(gè)發(fā)酵過程中呈上升趨勢,終點(diǎn)96h時(shí),豆粕中小肽含量達(dá)到26.78%(w/w),與單菌發(fā)酵相比,數(shù)值偏低。有機(jī)酸含量呈先上升,后下降,再穩(wěn)定的趨