版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、蛋白酶主要來源于微生物、動植物,可催化蛋白質(zhì)和多肽的肽鍵水解,使其降解為小分子的多肽或氨基酸等物質(zhì)。通過控制蛋白質(zhì)酶解過程制備功能性肽、功能性蛋白和風(fēng)味基料是實(shí)現(xiàn)其資源高值化利用的重要途徑。隨著酶解技術(shù)的成熟和蛋白質(zhì)控制酶解產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展,迫切需求開發(fā)新型特異性蛋白酶。蛋白酶在水產(chǎn)蛋白酶解過程中應(yīng)用普遍,但并非所有的蛋白酶都適合于水產(chǎn)蛋白,不同的蛋白酶對相同底物的水解能力差異很大。因此,選擇適宜的蛋白酶應(yīng)用于水產(chǎn)蛋白酶解至關(guān)重要,目前常
2、用的商品蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、陸生微生物蛋白酶,但海洋來源蛋白酶在水產(chǎn)蛋白加工中的應(yīng)用研究較少。微生物源蛋白酶不受資源、空間和環(huán)境的限制,而且大多為外源酶,擁有比動植物來源蛋白酶更大的優(yōu)越性。相比陸生微生物蛋白酶,海洋源微生物蛋白酶應(yīng)用于水產(chǎn)蛋白加工中可能具有近源性優(yōu)點(diǎn),對水產(chǎn)蛋白有更好的水解效果,使酶解產(chǎn)物具有不同的風(fēng)味和功能特性。
為開發(fā)海洋來源微生物蛋白酶,本文以海水養(yǎng)殖凡納濱對蝦腸道為研究對象,通
3、過2216E培養(yǎng)基對腸道微生物進(jìn)行分離純化,利用蛋白酶水解圈法初篩得到26株產(chǎn)蛋白酶菌株,測定菌株的透明圈直徑與菌落直徑比值(即D/d)初步估計(jì)其產(chǎn)酶能力,通過測定發(fā)酵液酶活力復(fù)篩得到一株高產(chǎn)蛋白酶菌株,編號為LVi-6,通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定、16S rDNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹分析進(jìn)行菌種鑒定,為鰻弧菌(Vibrio anguillarum)。
發(fā)酵粗蛋白酶液經(jīng)硫酸銨分級鹽析、Q-FF陰離子交換層析、S-100凝
4、膠過濾層析后,SDS-PAGE凝膠電泳呈單條帶,達(dá)到電泳純級,比活力從4035.11U/mg提高到10925.27U/mg,是初始的2.71倍,得率為47.03%。酶學(xué)性質(zhì)研究表明其最適反應(yīng)溫度為50℃,最適反應(yīng)pH值為7.5,為中溫中性蛋白酶。蛋白酶在40℃以下熱穩(wěn)定性較好,在60℃以上易失活,在pH6~8范圍內(nèi)pH穩(wěn)定性較好。Zn2+對蛋白酶有一定的激活作用,Co2+對蛋白酶有較強(qiáng)的激活作用;Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Ba2
5、+、Fe2+對酶活力作用不明顯;Cu2+、Hg+對該蛋白酶活力有較強(qiáng)的抑制作用,其中Hg+的抑制作用尤其強(qiáng)烈。EDTA對該蛋白酶有強(qiáng)烈的抑制作用,該蛋白酶是一種金屬蛋白酶。以酪素為底物,當(dāng)其濃度達(dá)到28g/L時酶活性達(dá)到最大;其動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax值分別為8.99g/L和5.90μg/(mL·min)。分別選用修飾劑DTNB、NBS、BrAc、乙酰丙酮、PMSF、甲醛對蛋白酶進(jìn)行修飾,結(jié)果表明該蛋白酶的巰基、組氨酸殘基、精氨酸殘基、
6、絲氨酸殘基與酶活性不直接相關(guān),不是該蛋白酶活性中心的必需基團(tuán);氨基和色氨酸殘基是該蛋白酶發(fā)揮活性的必需基團(tuán);經(jīng)NBS修飾后蛋白酶在278nm的特征吸收峰沒有發(fā)生變化表明其三級結(jié)構(gòu)沒有被破壞。
分別采用MALDI-TOF/TOF-MS、LC/MS/MS質(zhì)譜及Edman降解N-端氨基酸測序3種方法對該蛋白酶進(jìn)行鑒定。通過生物信息學(xué)分析得知其分子量為66725.61Dal,等電點(diǎn)為5.86,由611個氨基酸組成,其中疏水性氨基酸19
7、6個,極性氨基酸146個。Blast同源性分析得知該蛋白酶與Vibrio anguillarum金屬蛋白酶同源性達(dá)到99%,說明該蛋白酶有Vibrio anguillarum蛋白酶的序列結(jié)構(gòu)特征及相似功能。對Vibrioanguillarum金屬蛋白酶進(jìn)行同源建模和結(jié)構(gòu)預(yù)測得知該蛋白酶在中心凹陷位置有一保守區(qū)域,該區(qū)域是其和鋅離子結(jié)合的活性位點(diǎn),而酶學(xué)性質(zhì)研究推測其活性中心應(yīng)有Zn2+結(jié)合位點(diǎn)的存在,兩者結(jié)果吻合,表明該建模具有較高的理
8、論價值和實(shí)際意義。
為評估該蛋白酶的酶解特性,以酪蛋白作底物,對比該蛋白酶與商品蛋白酶的水解度、酶解液游離氨基酸含量及分子量分布差異,得知該蛋白酶對酪蛋白的水解度較高且酶解液游離氨基酸含量也較高,分子量在1000~5000Da和小于500Da范圍的含量高于其他蛋白酶。以蝦蛋白作底物,對比Vibrio anguillarum蛋白酶與中性蛋白的水解度、酶解液的游離氨基酸含量及DPPH自由基清除率得知該蛋白酶優(yōu)于中性蛋白酶對蝦蛋白的
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 蛋白酶高產(chǎn)菌株的篩選鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf
- 產(chǎn)低溫蛋白酶菌株的篩選及酶學(xué)特性研究.pdf
- 凡納濱對蝦絲氨酸蛋白酶抑制因子(Serpins)的鑒定及調(diào)控功能研究.pdf
- 章魚腸道產(chǎn)蛋白酶菌分離及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf
- 凡納濱對蝦蝦頭內(nèi)源性蛋白酶分離純化與酶學(xué)特性研究.pdf
- 海參腸道產(chǎn)蛋白酶菌的分離鑒定及酶學(xué)特性研究.pdf
- 章魚腸道產(chǎn)蛋白酶菌的分離鑒定及酶學(xué)特性研究.pdf
- 深海中產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)分析.pdf
- 29967.產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選與鑒定及幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)研究
- 耐熱堿性蛋白酶產(chǎn)生菌株的分離鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf
- 產(chǎn)蛋白酶海洋細(xì)菌的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf
- 中度嗜鹽菌產(chǎn)酯酶菌株的篩選鑒定、產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf
- 產(chǎn)高溫蛋白酶菌株的篩選及蛋白酶基因的克隆與表達(dá)研究.pdf
- 產(chǎn)高溫蛋白酶細(xì)菌的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf
- 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選與酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf
- 冷水魚腸道產(chǎn)低溫酶菌株的分離鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf
- 17650.產(chǎn)瓊脂酶菌株的篩選、產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)的研究
- 產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選鑒定、產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf
- 海洋來源產(chǎn)蛋白酶的菌株篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化研究.pdf
- 產(chǎn)低溫脂肪酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf
評論
0/150
提交評論