脂蛋白信號肽對纖維堆囊菌So0157-2木聚糖酶Xyn11B定位的影響.pdf

1、纖維堆囊菌S.cellulosum So0157-2能夠在以濾紙或木聚糖為唯一碳源的無機(jī)鹽平板上生長。由于纖維素和半纖維素的異質(zhì)性和復(fù)雜性，它們的降解需要多種酶的協(xié)同作用，這說明纖維堆囊菌S.cellulosum So0157-2中含有豐富的纖維素和半纖維素降解酶系能夠用來降解利用纖維素和半纖維素資源。
　　纖維堆囊菌對不可溶性多糖底物的利用呈現(xiàn)接觸性降解的特征。纖維素酶和木聚糖酶活力測定分析表明酶活力主要與細(xì)胞相關(guān)，而胞外組分活

2、力極低。因此推測相關(guān)酶類主要與細(xì)胞相結(jié)合。已測序的So0157-2基因組分析發(fā)現(xiàn):①基因組中很多多糖降解酶相關(guān)基因不具有引導(dǎo)目的蛋白分泌到細(xì)胞外的Ⅰ-型信號肽，這與胞外酶活力極低現(xiàn)象吻合。表明其多糖降解酶類主要不是以分泌到細(xì)胞外的游離形式而發(fā)生協(xié)同作用。②相對于接觸性降解的特征而言，So0157-2其基因組中也不含有纖維小體腳手架蛋白、粘附域、錨定域的同源基因序列，暗示著不存在纖維小體結(jié)構(gòu)。因此，基因組信息顯示纖維堆囊菌So0157-2

3、降解不溶性多糖的策略既不是胞外游離酶組分的協(xié)同作用方式，也不是纖維小體的高效復(fù)合體方式，可能采用與兩種經(jīng)典的微生物纖維素降解策略所不同的方式實現(xiàn)其對多糖底物的降解。
　　實驗室前期對So0157-2木聚糖酶Xyn11B的分析發(fā)現(xiàn)其具有脂蛋白信號肽、多聚絲氨酸區(qū)域及糖苷水解酶11家族催化域。因為其前兩個特征在目前研究過的多糖降解酶類中較為罕見而成為實驗室研究關(guān)注的目標(biāo)。對Xyn11B催化域的活性表達(dá)證明該酶組分在原始菌株纖維堆囊菌S

4、o0157-2中必然具有相應(yīng)的生理功能。Xyn11B酶學(xué)性質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)其對木聚糖水解產(chǎn)物只有木二糖的外切木聚糖酶特質(zhì)，也是GH11家族內(nèi)切木聚糖酶中未見報道過的。So0157-2木聚糖的酶Xyn11B脂蛋白信號肽及分揀序列特征引導(dǎo)的細(xì)胞定位與其底物降解特性和生理功能密切相關(guān)，也是解析其降解策略的基礎(chǔ)之一。脂蛋白信號肽能夠指引目的蛋白定位到內(nèi)膜或外膜上，具體位置與信號肽切割位點后的氨基酸序列相關(guān)。實驗室前期對纖維堆囊菌So0157-2的木

5、聚糖酶活力進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)有超過1/2的木聚糖酶活力位于膜組分中，說明定位在膜上的木聚糖酶在木聚糖降解中發(fā)揮了重要的作用。本實驗希望通過探究脂蛋白信號對木聚糖酶Xyn11B定位的影響，了解其脂蛋白信號肽及切點后的氨基酸序列對定位的影響規(guī)律，也會為推測纖維堆囊菌So0157-2的多糖降解方式提供一個證據(jù)。
　　本實驗對纖維堆囊菌So0157-2木聚糖酶Xyn11B基因的N端脂蛋白信號肽及其切點后的氨基酸序列特征進(jìn)行了分析，+2到+5位

6、的氨基酸[DGGA]。對纖維堆囊菌So0157-2全基因組中的糖苷水解酶的生物信息學(xué)分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)237個糖苷水解酶中有35個屬于脂蛋白，237個中有9個為木聚糖酶。GH11家族中所有細(xì)菌的木聚糖酶生物信息學(xué)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)有19個屬于脂蛋白，其中有5個來源于纖維堆囊菌。
　　由于在本源菌中遺傳操作的局限性，我們選擇將木聚糖酶Xyn11B進(jìn)行異源表達(dá)，分別選取了與纖維堆囊菌親緣關(guān)系較近的黃色粘球菌DK1622和同為革蘭氏陰性菌蛋白異源表

7、達(dá)常用的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。設(shè)置了Xyn11B基因全長和去掉脂蛋白信號肽的Xyn11 B-dlp兩個對照實驗組。
　　在黃色粘球菌DK1622中，以pZJY41為表達(dá)載體，成功構(gòu)建了pZJY41-X11B和pZJY41-X11B-dlp兩個重組表達(dá)載體。利用anti-Flag單克隆抗體進(jìn)行的WesternBlot檢測，確定了木聚糖酶Xyn11B在粘球菌DK1622表達(dá)。組分分離得到胞外濃縮組分（100倍）、細(xì)

8、胞全破碎組分、胞內(nèi)組分和膜組分。在Western Blot檢測中，含pZJY41-X11B重組表達(dá)載體菌株檢測到的強(qiáng)陽性信號在25kDa和33kDa處，分別為木聚糖酶Xyn11B催化域和去掉脂蛋白信號肽后表達(dá)產(chǎn)物，主要分布在胞內(nèi)組分中。含pZJY41-X11B-dlp重組表達(dá)載體菌株只在25kDa處檢測到陽性信號，主要分布于胞內(nèi)組分。以上結(jié)果表明兩個表達(dá)載體(pZJY41-X11B和pZJY41-X11 B-dlp)，無論設(shè)計是含有脂蛋

9、白信號肽還是不含有，實際上表達(dá)出的蛋白已經(jīng)從N-端截短，所以脂蛋白信號肽是不發(fā)揮作用的，從而使目的蛋白滯留在胞內(nèi)。超薄切片制備過程中選取4％多聚甲醛-0.5％戊二醛進(jìn)行菌體固定使菌體結(jié)構(gòu)保存完好。免疫金標(biāo)記前用10％H2O2刻蝕10min，免疫金顆粒實現(xiàn)對菌體細(xì)胞的特異性標(biāo)記。免疫金標(biāo)記結(jié)果顯示含有pZJY41-X11B和pZJY41-X11B-dlp重組表達(dá)載體的兩株菌的金顆粒都特異性的分布于胞內(nèi)，與Western Blot檢測結(jié)果相

10、符合。將Western Blot與免疫金標(biāo)記結(jié)果相結(jié)合，目的蛋白不明原因的降解或者剪切致使目的蛋白滯留在胞內(nèi)，不能確定脂蛋白信號肽對木聚糖酶Xyn11B定位的影響。
　　隨后，將木聚糖酶Xyn11B在大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)。以pET-22b為表達(dá)載體，成功構(gòu)建了pET-22b-X11B和pET-22b-X11 B-dlp兩個重組表達(dá)載體，獲得E.coli(22b)、E.coli(X11B)和E.coli(X11 B-d

11、lp)三個菌株。以樺木木聚糖為底物的活性檢測確定了目的蛋白的成功表達(dá)。通過組分細(xì)分得到了胞外濃縮組分、細(xì)胞全破碎、胞內(nèi)組分、周質(zhì)組分和膜組分。以β-半乳糖苷酶為胞內(nèi)標(biāo)志物，測定各組分中β-半乳糖苷酶的含量，說明組分分離過程和方法合適，分離的組分可以用于相應(yīng)的后續(xù)檢測。對各組分進(jìn)行酶活測定，在E.coli(X11B)菌株中，有超過80％的木聚糖酶酶活力存在于膜組分中;在E.coli(X11B-dlp)菌株中，木聚糖酶酶活力在胞內(nèi)組分和周質(zhì)

12、組分中分布較高。Western Blot檢測中，E.coli(X11B)菌株檢測到的強(qiáng)陽性信號在膜組分中;E.coli(X11B-dlp)菌株檢測到的強(qiáng)陽性信號在胞內(nèi)和周質(zhì)組分中。而在免疫金標(biāo)記結(jié)果中，在E.coli(X11B)菌株中分布于胞內(nèi)，在膜上并沒有預(yù)期的特異性金顆粒分布，可能由于蛋白上的His標(biāo)簽被膜上的磷脂分子阻擋不能與抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。在E.coli(X11B-dlp)菌株中，周質(zhì)組分雖有少量金顆粒存在，還不能確定為特異